ENDOTOKSINAS (LPS) ATEROSKLEROZĖS PATOGENEZĖJE =

Konev Yu.V., Lazebnik L.B.

Valstybinė sveikatos priežiūros įstaiga Maskvos sveikatos priežiūros departamento centrinis gastroenterologijos tyrimų institutas

Konevas Jurijus Vladimirovičius 111123, Maskva, Entuziastov plentas, 86 El. paštas: gastroen ter@rambler. ru

Šiuolaikiniai duomenys apie procesus, kuriais grindžiama aterogenezė, rodo reikšmingą žarnyno mikrofloros endotoksino (lipopolisacharido – LPS) vaidmenį kraujagyslių pažeidimų vystymuisi. Darbe apibendrinama literatūra ir mūsų pačių atliktų tyrimų apie gramneigiamų bakterijų LPS dalyvavimą aterosklerozės pradžioje ir progresavime rezultatai. Įrodyta, kad gramneigiamų bakterijų LPS sąveikauja su TLR4, sukeldamas citokinų kaskadą ir vėliau formuojantis ateromos.

Raktažodžiai: endotoksinas; LPS; aterosklerozė; aterogenezė; TLR. SANTRAUKA

Naujausi duomenys apie procesus, kuriais grindžiama aterogenezė, rodo reikšmingą žarnyno mikrofloros endotoksino (lipopolisacharido – LPS) vaidmenį kraujagyslių pažeidimų vystymuisi. Šiame darbe apibendrinama literatūra ir materialiniai jų tyrimų rezultatai apie LPS gramneigiamų bakterijų dalyvavimą aterosklerozės inicijavime ir progresavime. Įrodome, kad gramneigiamų bakterijų LPS sąveikauja su TLR4, sukelia citokinų kaskadą ir vėliau susidaro ateroma. Raktažodžiai: endotoksinas; LPS; aterosklerozė; aterogenezė; TLR.

Šiuo metu mirčių nuo aterosklerozės skaičius gerokai viršija mirčių nuo kitų ligų skaičių. Koronarinė širdies liga, hipertenzija, išeminiai smegenų pažeidimai, lėtinė apatinių galūnių išemija, lėtinė išeminė virškinimo organų liga – tai ne visas rimtų ligų, pagrįstų ateroskleroziniais kraujagyslių sienelės pažeidimais, sąrašas. Aterosklerozės patogenezė yra sudėtinga ir įvairi, o involiucijos proceso metu staigiai padidėja rizikos veiksnių dažnis ir intensyvumas, o tai lemia aukštą vyresnio amžiaus žmonių sergamumą ateroskleroze. Tačiau kai kurie bendrieji biologiniai mechanizmai, lemiantys aterosklerozinio proceso atsiradimą, nebuvo pakankamai ištirti.

Šiuo metu plačiausiai priimtas įsitikinimas, kad aterosklerozė yra lėtinė liga, kurios pagrindas yra endotelio pažeidimas ir pluoštinių aterosklerozinių plokštelių susidarymas arterijos sienelėje.

Iki šiol, nepaisant siūlomų variantų, priežastis, sukelianti aterosklerozinės plokštelės susidarymą, lieka neaiški. Pastarųjų metų tyrimai rodo, kad šiuose procesuose gali dalyvauti endotoksinas, kurio perteklinį susidarymą skatina disbiotiniai žarnyno pokyčiai, kurie taip dažnai būna vyresniame amžiuje.

Endotoksinas yra lipopolisacharidas (LPS), gramneigiamų bakterijų ląstelės sienelės išorinės membranos dalis, turintis platų įvairaus biologinio aktyvumo spektrą.

Paprastai iš žmogaus storosios žarnos į kraują prasiskverbia tik nedidelis LPS kiekis, nes žmonės turi daugybę humoralinių ir ląstelinių faktorių, kurie suriša LPS: didelio specifinio tankio lipoproteinų, antikūnų, ypač antikūnų prieš Re glikolipidą, Kupfferio ląsteles, polimorfonukleariniai leukocitai ir makrofagai. Dar visai neseniai buvo manoma, kad fiziologinėmis sąlygomis LPS prasiskverbia iš žarnyno

tik į vartų veną, kur daugiausia sugauna Kupfferio ląstelės, tačiau naujausi tyrimai parodė, kad sveikų žmonių organizme ir net naujagimiams endotoksino randama nedideliais kiekiais sisteminėje kraujotakoje, kraujo plazmoje ir polimorfonuklearinių ląstelių paviršiuje. leukocitų. Normaliai funkcionuojantys antiendotoksiniai faktoriai gana efektyviai apsaugo organizmą nuo žalingo LPS poveikio fiziologinėmis sąlygomis. Tačiau situacija labai pasikeičia esant stresui, prasiskverbiančios spinduliuotės ir kitų aplinkai kenksmingų veiksnių poveikiui, įvairioms infekcinės ir neinfekcinės kilmės ligoms. Tokiomis sąlygomis ne tik padidėja LPS prasiskverbimas į sisteminę kraujotaką, bet ir išsenka antiendotoksino imuniteto veiksniai. Tuo pačiu metu smarkiai sumažėja antikūnų prieš Re chemotipo glikolipidą, neutralizuojančių endotoksiną, ir PMN, kurie jungiasi su LPS in vivo, kiekis kraujyje. PMN, galintys surišti LPS in vitro, taip pat praktiškai išnyksta. Kitaip tariant, antikūnų ir granulocitų surišimo LPS atsargos išnyksta ir organizmas tampa beveik visiškai neapsaugotas nuo pasikartojančių LPS, naujai patenkančių į kraują, priepuolių.

Pirminės arba pradinės sisteminio endotoksino poveikio stadijos atsiranda dėl LPS sąveikos su įvairiomis kraujo ir audinių ląstelėmis, taip pat kraujo lipoproteinais. Iš ląstelių, kurios priima endotoksiną, pagrindiniai endotoksino dalyviai ir induktoriai yra endotelio ląstelės, trombocitai, makrofagai, neutrofilai, bazofilai, putliosios ląstelės ir hepatocitai, o tai rodo, kad ląstelės nėra selektyvaus endotoksino surišimo.

Pažymėtina, kad didelė endotoksino dalis yra pernešama į organus ir audinius komplekse su mažo tankio lipoproteinais (MTL), o endotoksino fiksavimas įvairiose kraujo ląstelėse, mezenchimose ir organui būdinguose elementuose daugiausia vyksta dėl Toll-pattern atpažinimo receptoriai (PRR) ant jų membranų.panašaus tipo (TLR).

Aktyvus ląstelių LPS priėmimas organizme paaiškina disociacijos tarp vidutinio LPS kiekio ir „endotoksinų agresijos“ reiškinių, kai, esant mažam cirkuliuojančio endotoksino kiekiui kraujyje, susidaro būdingas endotoksinų kaskados vaizdas, iki šokas.

Endotoksino pašalinimas iš sisteminės kraujotakos yra dvifazis: po greito LPS adsorbcijos ant kraujo ląstelių, jis daugiausia nusėda kepenyse, o žymiai mažesnėmis koncentracijomis - blužnyje, žarnyne, plaučiuose ir inkstuose, o vėliau dalyvauja jų pažeidimai. citokinų.

Ankstyvuoju "endotoksinų agresijos" laikotarpiu padidėja ūminės fazės susidarymas

baltymai: C reaktyvusis baltymas, transferinas, rūgštinis α1-glikoproteinas, haptoglobinas, IL-6, kas koreliuoja su endotoksemijos laipsnio sunkumu. Ir, žinoma, ūminės fazės baltymai aktyviai dalyvauja surišant ir inaktyvuojant endotoksino perteklių.

Endotoksino pašalinimą iš sisteminės kraujotakos užtikrina antikūnai prieš LPS šerdies determinantus, taip pat neimunoglobulino pobūdžio inhibitoriai. Pastebėtas ryškus detoksikuojantis didelių dozių heparino poveikis, kuris aktyvuoja lipoproteinų lipazę, kuri savo ruožtu naikina LPS.

Yra pranešimų apie lizocimo, interferono, makroglobulinų, termolabaus serumo inaktyvatoriaus, turinčio esterazės aktyvumą, fosfatazės, komplemento, kraujo baltymo a-globulino frakcijos, kurios sedimentacijos konstanta yra 4,5, dalyvavimą LPS detoksikacijos procesuose.

Tam tikrą vaidmenį kraujo plazmos endotoksinų surišimo veikloje atlieka didelio specifinio tankio lipoproteinai, kurie gali sudaryti stabilų kompleksą su LPS.

LPS detoksikacija ir skaidymas ląstelėse vykdomas dalyvaujant įvairioms fermentinėms sistemoms: lipoksigenazėms, fosforilazėms, deacetilazėms, defosforilazėms.

Nepaisant to, yra žinoma, kad pagrindinės kraujo ląstelės, priimančios LPS, yra polimorfonukleariniai leukocitai (PMN), makrofagai ir trombocitai. Nustatyta, kad jau praėjus 1-2 minutėms po endotoksino vartojimo, apie 40% PMN paviršiuje yra endotoksino, o 30 minutę endotoksinų turintys PMN yra sekvestruojami plaučių, kepenų, inkstų, blužnies ir blužnies mikrokraujagyslėse, mažesniu mastu – antinksčiuose, pradėdamas šių organų pažeidimus. Nustatyta, kad endotoksinų stimuliuojama neutrofilų sekvestracija plaučiuose nėra susijusi su padidėjusia PAF ir tromboksano A2 gamyba, o dėl padidėjusios L-selektino gamybos.

30-60 minučių po endotoksino Sl suleidimo. typhi murium triušiams sumažėjo mieloperoksidazės aktyvumas ir katijoninių baltymų kiekis PMN, pasiekęs maksimumą po 3 valandų.

Netiesiogiai, padidindamas fibronektino gamybą, Salmonella endotoksinas padidina neutrofilų chemotaksinį ir adhezinį aktyvumą, padidina superoksido anijonų radikalo PMN susidarymą.

Sudėtinga dinaminė kraujo ir endotoksinų surišimo sistemų sąveika lemia kraujo reologinių savybių pokyčių, hemostazės ir mikrocirkuliacijos pokyčių intensyvumą sisteminės endotoksemijos metu.

Makrofagų, PMN, surišimas su endotoksinu, viena vertus, skatina apsauginių reakcijų komplekso vystymąsi, kita vertus, citokinų gamybą ir citokinų sukeltą įvairių organų ir audinių sunaikinimą.

Taigi, pavyzdžiui, endotoksinas (LPS), išorinio gramneigiamų bakterijų apvalkalo komponentas, sąveikauja su LPS rišančiu baltymu (LBP) ir yra transportuojamas į kepenis. Kepenų makrofagai (žvaigždiniai retikulocitai) ir monocitai yra aktyvuojami ir išskiria uždegimo mediatorius. Tai yra būtina sisteminio uždegiminio atsako sindromo (SIRS) išsivystymo sąlyga.

LPS gali prisidėti prie žarnyno barjero disfunkcijos išsivystymo naudojant šį mechanizmą. Didelės koncentracijos LPS tiesiogiai aktyvuoja žarnyno endotelio CD14 ląsteles, todėl prarandamas endotelio vientisumas.

Svarbų vaidmenį aterogenezėje vaidina lėtinis uždegiminis procesas, lemiantis kraujagyslių sienelės endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelių kitimo ir proliferacijos vystymąsi bei arterijų intimoje lokalizuotų makrofagų aktyvavimą. Pertekliniai aktyvuoti makrofagai sugeria cholesterolį iš mažo tankio lipoproteinų ir dėl to virsta putplasčio ląstelėmis, kurių atsiradimas yra vienas iš ankstyvųjų ateromos formavimosi požymių.

Vienas iš endotoksinų veikimo mechanizmų realizuojamas dėl endotelio disfunkcijos. Visų pirma, endotelio disfunkcija turėtų būti įvardijama kaip pagrindinė pacientų mirties priežastis, praėjus keleriems metams po peritonito.

Nepriklausomai nuo priežasties, pagrindinės įvairių patologijų endotelio disfunkcijos patogenezės jungtys yra disbiozė, per didelis endotoksinų patekimas į portalą ir sisteminę kraujotaką, sutrikusios kepenų metabolinės funkcijos ir sisteminė uždegiminė reakcija. Jie sudaro uždarą patologinę sistemą, kurios pagrindinis tikslas yra endotelis, įskaitant kepenų retikuloendotelinės sistemos sinusoidus.

Ryžiai. 1. Kraujagyslės sienelės pažeidimo patogenezė endotoksinų agresijos metu

CD14 ląstelių receptoriai, esantys ant makrofagų, polimorfonuklearinių leukocitų, endotelio ląstelių membranų, juos aktyvuoja, skatindami šių ląstelių citokinų ir kitų uždegiminės reakcijos mediatorių – komplemento, vazoaktyvių mediatorių, arachidono rūgšties metabolitų, adhezinų, kininų, trombocitus aktyvinančių medžiagų – gamybą. veiksniai, histaminas, endotelinai, krešėjimo faktoriai, reaktyvieji deguonies radikalai ir azoto oksidas (NO). Šis tarpininkas yra apdovanotas pagrindinėmis patologinėmis galiomis formuojant endotelio disfunkciją bet kurioje situacijoje.

Susintetintas NO turi ir autokrininį, ir parakrininį poveikį, tai yra, veikia medžiagų apykaitos procesus tiek pačiose ląstelėse, tiek šalia esančiose. NO ląstelių taikiniai yra geležies turintys fermentai ir baltymai (guanilatciklazė, NO sintetazė, mitochondrijų kvėpavimo fermentai, Krebso ciklo fermentai, baltymų ir DNR sintezės fermentai); baltymų SH grupės ir tt Kai NO jungiasi su deguonimi, susidaro itin toksiški junginiai – peroksinitritai. NO ir L-cirulino susidarymą katalizuoja fermentas sintetazė (NOS) iš L-arginino. Yra žinomi trys NOS tipai: neuroninis (nNOS), endotelinis (eNOS) ir indukuojamasis (iNOS). Fiziologinėmis sąlygomis NO sintezę užtikrina nNOS ir eNOS sintetazės, o iNOS sintezė didėja tik reaguojant į patogeninius dirgiklius: iNOS geno ekspresiją skatina IL-1, interferonas-γ, TNF-a ir gramneigiamo endotoksinas. bakterijos. Fiziologinėmis sąlygomis šios

mechanizmus, kuriuose dalyvauja NO, makrofagai naudoja naikinti naviko ląsteles, kurios ne tik pačios gamina NO, bet ir išskiria TNF-a, taip sukeldamos jose iN0S sintezę. Be proapoptotinio vaidmens, iN0S aktyvinimas yra svarbus palaikant imunitetą ūminio ir lėtinio uždegimo metu.

Patologinio NO poveikio ribojimas ir jo inaktyvavimas atliekamas naudojant superoksido radikalą O2, kurio fagocitinių ar endotelio ląstelių gamybos kraujotakos sistemoje padidėjimas sukelia spazmą ir yra pagrindas vystytis. vėlesnis ED. Oksiduotos ir glikozilintos mažo tankio lipoproteinų (MTL) formos turi panašų poveikį: jos slopina eNOS makrofaguose ir endotelio ląstelėse.

Tačiau žalingo endotoksino poveikio endotelio ląstelėms mechanizmai yra akivaizdžiai nepakankami. Žinoma, šis veiksmas vyksta per polimorfonuklearinius leukocitus. Šiuo metu yra žinomi keli LPS sąveikos su PMN ir makrofagais tipai: a) LPS jungiasi prie CD18 receptoriaus baltymo ir toks jungimasis nėra būtinas leukocitų aktyvavimui;

b) LPS pirmiausia prisijungia prie plazmos LBP baltymo, o po to, kartu su šiuo baltymu, reaguoja su CD14 receptoriumi, dėl ko suaktyvėja leukocitai;

c) nespecifinė LPS sąveika su ląstelių membranomis. Prie to taip pat reikėtų pridėti aprašytą nuo Fc priklausomą LPS jungimąsi ląstelėmis, sustiprintomis antiendotoksinais antikūnais. Šių tipų įrišimo indėlis į projekcinį ir

Patogenetinis granulocitų vaidmuo dar nebuvo ištirtas. Matyt, LPS sąveikos su leukocitais baigtis ir LPS sukeltų PMN savybės priklauso nuo endotoksino koncentracijos: esant santykinai mažoms koncentracijoms pasireiškia aktyvacija ir teigiamas (fiziologinis) poveikis, esant didelei koncentracijai – hiperaktyvacija, leukocitų perteklius. su endotoksinu ir patologiniu poveikiu (organopatologijos raida). Kai leukocitai yra hiperaktyvūs ir sunaikinami, į aplinką patenka daug fermentų, ypač elastazė ir kiti lizosominiai fermentai, kurie gali turėti žalingą poveikį endotelio ląstelėms.

Mūsų tyrimai leido nustatyti faktą, kad vyresnio amžiaus žmonių kraujyje yra gana aukšti antiglikolipidinių antikūnų titrai. Faktas, kad su amžiumi antikūnų titras išliko beveik nepakitęs, rodo, kad involiuciniame amžiuje palaikoma savų antikūnų prieš endotoksiną sintezė, o tai taip pat netiesiogiai patvirtina universalų endotoksino poveikį žmogaus organizmui.

Be to, vyresnio amžiaus žmonėms, turintiems aterosklerozės simptomų, aptikome antiendotoksinų apsaugos granulocitų komponento susilpnėjimo reiškinį. Tiriant kraujo tepinėlius LPS testu, buvo nustatytas beveik visiškas ne tik granulocitų endotoksinų surišimo atsargų nebuvimas, bet ir nepakankamas LPS teigiamų leukocitų kiekis kraujyje arba visiškas jų nebuvimas. Endotoksino prisijungimas prie granulocitų yra labai svarbi antiendotoksinų gynybos ir LPS šalinimo funkcijos dalis. Be to, endotoksino priėmimas granulocitams suaktyvina šių ląstelių antimikrobinį potencialą ir yra svarbi bendro organizmo antibakterinio atsparumo grandis. Atrodo, kad vietinių LPS teigiamų PMN sumažėjimas vyresnio amžiaus žmonių sisteminėje kraujotakoje yra tam tikro su amžiumi susijusios šios ląstelių populiacijos, kuri, kaip žinoma, veikia kaip pirmasis antibakterinis barjeras, nepilnavertiškumo pasekmė. Ko gero, ši aplinkybė paaiškina vyresnio amžiaus žmonių organizmo jautrumą nepalankiai aterosklerozės komplikacijų, ypač bakterinių infekcijų, eigai.

LPS teigiamų granulocitų kiekio sumažėjimas bendroje vyresnio amžiaus žmonių kraujotakoje, esant pakankamai dideliems antiglikolipidinių antikūnų titrams, mūsų nuomone, rodo tam tikrą vyresnio amžiaus ir pagyvenusių žmonių PMN nesugebėjimą apskritai prisijungti prie Fc ( tai yra kiti antigenai), o tai, žinoma, rodo tam tikrą su amžiumi susijusį polimorfonuklearinės leukocitų sistemos „trūkumą“ involiucinio periodo asmenims.

Leukocituose esant endotoksino pertekliui, taip pat suaktyvėja lipidų peroksidacijos fermentai, kurių galutiniai produktai taip pat gali sukelti endotelio pažeidimus.

Endotoksino veikimas endotelyje taip pat gali apimti komplemento sistemą, kurią aktyvuoja endotoksinas. Visų pirma, komplemento frakcija C5a sąveikauja su LPS.

Galiausiai, dar vienas galimas endotoksino veikimo mechanizmas ant endotelio. Endotelio ląstelių paviršiuje yra fibronektino, kuris vaidina svarbų vaidmenį ląstelių ir ląstelių sąveikoje bei ląstelių prisijungime prie posluoksnio. Plazmos fibronektinas yra antigeniškai identiškas ląstelės paviršiuje esančiam fibronektinui, taip pat dalyvauja ląstelių prijungime viena prie kitos ir prie bazinės membranos. Endotoksemijos metu plazmos fibronektiną gali sunaikinti leukocitų proteazės ir suvartoti kaip opsoniną, o tai gali sukelti jo išplovimą iš endotelio ląstelių paviršiaus ir jų lupimąsi. Suleidus endotoksino, endotelio ląstelės randamos 88 % eksperimentinių gyvūnų kraujyje, o prieš vartojimą jų buvo tik 12 % sveikų gyvūnų.

Prielaida apie galimą LPS vaidmenį aterosklerozės patogenezėje buvo patvirtinta pastaraisiais metais intensyviai kaupiant ir tiriant medžiagas apie modelių atpažinimo receptorių (PRR) vaidmenį įgimto imuniteto mechanizmuose. šiuo metu tęsiasi. ORR koncepciją pirmasis pasiūlė S.A. Janeway. Šiuo metu žinomos kelios OPP šeimos. Beveik visi ORR yra signaliniai, jie atpažįsta daugiausia pašalinius komponentus (ligandus), praneša apie jų patekimą ir sukelia reakcijų kaskadą, užtikrinančią signalo perdavimą ląstelės branduoliui ir daugelio bioaktyvių molekulių sintezės pradžią. Šiuo metu labiausiai ištirti į To11 panašūs receptoriai (TLR). Jų yra ant epitelio ir endotelio ląstelių, ant monocitų ir makrofagų, polimorfonuklearinių leukocitų, dendritinių ir kitų ląstelių, kurios liečiasi su svetimkūniais. Žmonėms yra žinoma 10 TLR. Ląstelės paviršiuje yra lokalizuoti TLR 1, 2, 4, 5, 6 ir 10 receptoriai, atpažįstantys mikroorganizmų paviršiaus komponentus, o 3, 7, 8 ir 9 TLR receptoriai, kurie suriša virusinių ir bakterinių nukleorūgščių struktūras. , yra endoplazminiame tinkle.

TLR vaidina labai svarbų vaidmenį makroorganizmo fiziologijoje (2 pav.). Po sąveikos su mikrobų ar virusų ligandais jie lemia uždegimą skatinančių ir priešuždegiminių citokinų, defenzinų sintezę, skatina įgimtas ir adaptacines reakcijas.

Ryžiai. 2. TLR receptorių tipai (Akira ir kt., 2003)

imunitetą, užtikrinti žarnyno mikrofloros dalyvavimą palaikant homeostazę ir taisant gleivinės epitelio ląstelių pažeidimus. Mokslininkai iš Jungtinių Valstijų, remdamiesi naujausių eksperimentų rezultatais, padarė išvadą, kad TLR receptoriai atlieka bent dvi funkcijas: 1) apsaugo nuo infekcijos ir 2) palaiko audinių homeostazę.

Yra gana aiškiai apibrėžtas IgB reakcijų specifiškumas. su skirtingomis struktūromis. Taigi jis atlieka svarbų vaidmenį makroorganizmo ląstelių atsake į gramneigiamų bakterijų LPS, be to, atpažįsta šilumos šoko baltymą p60, fibronektino peptidus ir kai kuriuos kitus komponentus. formuoja dimerus su gramteigiamų bakterijų peptidoglikanu ir atpažįsta bei atpažįsta lipoteiko rūgštį, zimozaną, diacilo lipopeptidą, šilumos šoko baltymą p70 ir kitas struktūras. suriša flagellinus

gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų. Receptoriai IB3, 7, 8, 9 atpažįsta bakterijų ir virusų DNR, virusinę dvigrandę RNR ir kai kurias nemetilintų deoksioligonukleotidų sekas.

Šis IgB reakcijų specifiškumas leido nustatyti jų funkcijas ir vaidmenį tam tikrų patologinių procesų patogenezėje. Taigi, esant 1:1r4 geno, koduojančio IgB4 receptoriaus sintezę, mutacijai, atsakas į LPS išnyksta, jautrumas infekcijoms, kurias sukelia gramneigiamos bakterijos, smarkiai padidėja, tačiau sumažėja rizika susirgti ateroskleroze ir miokardo infarktu. . Kartu mažėja ir cirkuliuojančių priešuždegiminių citokinų, fibrinogeno ir tirpių adhezinų, kurie dalyvauja formuojantis aterosklerozinėms plokštelėms ant kraujagyslių sienelių ir progresuojant aterosklerozei, koncentracija. Taigi buvo gauta įrodymų apie svarbų ThB4 vaidmenį aterosklerozės patogenezėje, taip pat LPS, vieno iš pagrindinių ligandų, svarbą, kaip priežastinį veiksnį.

sukelti reakcijas, kurios galiausiai gali sukelti

kraujagyslių sienelės aterosklerozinių pažeidimų susidarymas.

Publikacija apie chlamidijų LPS vaidmenį inicijuojant aterogenezę pasirodė dar 1998 m., tačiau pranešimai apie galimą bakterinės LPS vaidmenį inicijuojant aterosklerozinius pažeidimus pasirodė gerokai anksčiau. Visų pirma, buvo įrodyta, kad LPS sukelia endotelio pažeidimus eksperimentiniams gyvūnams. Taip pat buvo nustatyta, kad LPS iš E. coli ir S. typhimurium skatina lipidų kaupimąsi makrofaguose, kai jie yra kultivuojami esant vietiniams mažo tankio lipoproteinams. Šios medžiagos leido pasiūlyti ryšį tarp endotoksemijos ir aterosklerozės. Taip pat pasirodė pirmosios klinikinės medžiagos, patvirtinančios šią prielaidą. Ilgalaikiai gana didelio skaičiaus koronarine širdies liga sergančių pacientų stebėjimai parodė, kad pacientams, kurių kraujyje yra daug endotoksinų, miokardo infarktas išsivystė kelis kartus dažniau. Endotoksino koncentracija taip pat buvo didelė pacientų, sergančių lėtine apatinių galūnių išemija, kraujyje, o klinikinės ligos eigos sunkumas koreliavo su endotoksino koncentracija kraujyje.

Nuo 1992 m., po BONE tyrimo, susiformavo sisteminio uždegiminio atsako sindromo (SIRS) samprata. Netgi I.I. Mechnikovas nurodė uždegimą, ypač jo kraujagyslių komponentą, kaip universalią apsauginę reakciją. Tuo pačiu metu I.I. Mechnikovas pažymėjo ne tik apsauginio poveikio nuo uždegiminio sindromo, bet ir žalingo poveikio paciento organams ir sistemoms galimybę. Dabar įrodyta, kad SIRS pasireiškia ne tik visomis ekstremaliomis sąlygomis – politrauma, sunkios infekcijos, crist sindromas, sunki hipertenzija, pankreatitas, sunkios operacijos ir kt. Sisteminio uždegiminio atsako sindromo detalės tapo aiškesnės po apibrėžimo.

citokinus ir jų funkcijas. Iki šiol yra žinomos sisteminio uždegiminio atsako sindromo ir dauginio organų nepakankamumo vystymosi stadijos, kurias daugiausia lemia endotoksinas.

LPS reakcijos su makroorganizmo ląstelėmis baigtis priklauso nuo jo koncentracijos (3 pav.). Vidutinis ląstelių ir sistemų aktyvavimas esant mažoms endotoksino dozėms sukelia SIRS vystymąsi, pasireiškiantį vietiniais audinių pažeidimais. Padidinus dozę iki vidutiniškai padidėjusio endotoksino kiekio, pradeda pasireikšti sisteminės reakcijos, pasireiškiančios ūminės fazės atsaku ir karščiavimu. Ir galiausiai, didelis LPS lygis sukelia hiperaktyvaciją, kurią lydi padidėjusi auglį nekrozuojančio faktoriaus-a ir daugelio kitų mediatorių gamyba, padidėjęs komplemento sistemos ir kraujo krešėjimo faktorių aktyvavimas, dėl kurio gali išsivystyti tokie. rimtų komplikacijų, tokių kaip diseminuota intravaskulinė koaguliacija (DIK), endotoksinis šokas ir ūminis dauginis organų nepakankamumas.

Priklausomai nuo dozės, LPS sukelia ląstelių pažeidimus arba skatina daugelio fiziologiškai aktyvių mediatorių, tokių kaip endogeninis pirogenas, interleukinai, auglį nekrozuojantis faktorius ir kt., sintezę.

Tirta sisteminio uždegiminio atsako sindromo įtaka hemostazei ir trombofilinės būklės išsivystymui. Tačiau sisteminio uždegiminio atsako sindromo apraiškos, susijusios su įvairiomis medicinos sritimis, nebuvo pakankamai ištirtos. SIRS metu atsirandantys patofiziologiniai pokyčiai dar nėra pakankamai atspindėti gydymo taktikoje.

Naujausi tyrimai parodė, kad žarnynas vaidina pagrindinį vaidmenį sisteminio uždegiminio atsako sindromo (SIRS) išsivystymo ir jo kraštutinės apraiškos – dauginio organų nepakankamumo – patogenezėje. Žarnynas yra ne tik organas, atsakingas už organizmo aprūpinimą reikalingomis maistinėmis medžiagomis. Norint išlaikyti žarnyno gleivinės vientisumą, būtinas maistinių medžiagų buvimas. Žarnynas atlieka endokrinines, imunines, metabolines ir mechanines barjerines funkcijas. Virškinimo trakto gleivinės sluoksnio vientisumo palaikymui ir regeneracijai įtakos turi daug veiksnių. Tai virškinimo trakto peptidai, enterogliukagonas, tiroksinas, riebalų rūgštys, augimo hormonas, Pejerio pleistrai, limfocitai, makrofagai, imunoglobulinas A tulžies sekrecijoje. Žarnyno sienelė gausiai išklota limfoidiniu audiniu, kuris sąveikauja su žarnyno bakterine flora ir mitybos veiksniais; Paprastai bakterijos ir toksinai iš žarnyno spindžio nedideliais kiekiais prasiskverbia per vartų venų sistemą į kepenis, kur juos išvalo Kupfferio ir retikuloendotelinės ląstelės. Normali mikroflora, būdama simbiotinė, atlieka daugybę makroorganizmui būtinų funkcijų. Tai apima nespecifinę apsaugą nuo žarnyno infekcijas sukeliančių bakterijų, pagrįstą mikrobų antagonizmu ir dalyvavimu antikūnų gamyboje bei mikroorganizmų, ypač vitaminų C, K, B, B2, B6, B, PP, folio, vitaminų sintezės funkciją. ir

Ryžiai. H. Endotoksinas ir uždegimas

pantoteno rūgštys. Be to, žarnyne gyvenantys mikrobai skaido celiuliozę, dalyvauja fermentiniame baltymų, riebalų ir didelės molekulinės masės angliavandenių skaidyme, skatina kalcio, geležies, vitamino D pasisavinimą, dėl rūgščios aplinkos sukūrimo dalyvauja. keičiasi tulžies rūgštimis ir susidaro sterkobilinas, koprosterolis gaubtinėje žarnoje, deoksicholio rūgštis, dalyvauja formuojant baltymų skilimo produktus (fenolis, indolas, skatolis), kurie normalizuoja žarnyno judrumą. Normali bakterinė mikroflora skatina makrofagų-histiocitinės sistemos „brendimą“ ir veikia žarnyno gleivinės struktūrą bei absorbcinį pajėgumą.

Žarnyno mikroflora skirstoma į privalomąją, fakultatyvinę ir laikinąją.

Privalomoji mikrofloros dalis nuolat yra normalios floros dalis ir lemia daugybę medžiagų apykaitos procesų bei apsaugo šeimininką nuo infekcijos. Fakultatyvinė dalis, randama sveikiems žmonėms, kai sumažėja mikroorganizmo atsparumas, gali veikti kaip etiologinis ligos veiksnys. Laikinoji dalis paprastai aptinkama atsitiktinai, nes ji negali ilgai gyventi makroorganizme.

Išmatų bakteriologinio tyrimo rezultatus dažnai iškyla sunkumų dėl didelių jų svyravimų net ir praktiškai sveikiems žmonėms, o tam pačiam pacientui sparčiai besikeičiančios rodiklių kaitos kartotinių tyrimų metu be jokio šablono. Be to, žinoma, kad išmatų mikroflora ne visada atspindi žarnyno parietalinės, kriptos ir, ko gero, net intraluminalinės (ertmės) mikrofloros turinį.

Žarnyno gleivinė nuolat atnaujinama, pasižymi dideliu metaboliniu aktyvumu, todėl yra labiau pažeidžiama išemijos ir atrofijos. Jei epitelio ląstelės neturi nominalaus maistinių medžiagų antplūdžio, sumažėja reprodukcijos ir ląstelių migracijos aktyvumas, taip pat DNR sintezė ir žarnyno barjerinė funkcija.

Atsižvelgiant į tai, paprastai tik nedidelis LPS kiekis prasiskverbia iš žarnyno spindžio į kraują, nes žmonės turi daugybę humoralinių ir ląstelinių faktorių, kurie suriša LPS: didelio specifinio tankio lipoproteinų, antikūnų, ypač antikūnų prieš Rae glikolipidą. chemotipas, Kupferio ląstelės, polimorfonukleariniai leukocitai ir makrofagai. Antiendotoksiniai faktoriai pakankamai efektyviai apsaugo organizmą nuo LPS pertekliaus fiziologinėmis sąlygomis. Tačiau situacija smarkiai pasikeičia esant nepalankioms aplinkos sąlygoms ir įvairioms ligoms, todėl mažėja antiendotoksinų imuniteto faktoriai. Tuo pačiu metu smarkiai sumažėja antikūnų prieš LPS titrai,

PMN, kurie suriša endotoksiną in vivo kraujyje, kiekis. PMN, galintys surišti endotoksiną in vitro, taip pat praktiškai išnyksta. Staigiai sumažėja antikūnų ir granulocitų endotoksinų surišimo atsargos, organizmas tampa beveik visiškai neapsaugotas nuo pakartotinių endotoksino priepuolių, vėl patekusių į kraują, ir suvokiamas jo patofiziologinis poveikis.

Taigi, J. Meakins ir J. Marshall dar 1986 metais pirmą kartą iškėlė hipotezę apie SIRS ir MODS atsiradimą dėl žarnyno gleivinės pralaidumo pokyčių, dėl kurių bakterijos ir toksinai persikėlė į kraujotakos sistemą.

Akivaizdu, kad aterosklerozės patogenezė yra pagrįsta reakcijomis, kurias sukelia į To11 panašių receptorių sąveika su egzogeniniais ir endogeniniais ligandais. Ligandais stimuliavus į To11 panašius receptorius, signalas perduodamas į ląstelės branduolį ir suaktyvinamas transkripcijos faktorius RT-κB, dėl kurio atsiranda daugybė priešuždegiminių ir priešuždegiminių citokinų, apsauginių faktorių ir kt. biologiškai aktyvios molekulės, įskaitant adhezijos faktorius. Endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelių aktyvinimas ir keitimas, makrofagų aktyvinimas arterijų intimoje ir jų pavertimas

ENDOTOKSINO AGRESIJA (PATOFISIOLOGINIS ENDOTOKSINO POVEIKIS)

Endotoksino taikinys Išsiskyrusios medžiagos Patofiziologinis poveikis Klinikinės apraiškos

Makrofagai 1b-1; TOT-a; 1Р^у; P-6 Fagocitų aktyvinimas; prostaglandinų išsiskyrimas pagumburyje; visų uždegiminių reakcijų reguliavimo panaikinimas; N0 sukelta vazodilatacija Karščiavimas; galvos svaigimas; padidėjęs kapiliarų pralaidumas, ypač plaučiuose

Indukuojamas NO išsiskyrimas

Komplementas C3a Kraujagyslių išsiplėtimas padidino kapiliarų pralaidumą; fagocitų aktyvacija Hipotenzija; hemoraginis sindromas

Trombocitai Trombocitus aktyvuojantis faktorius Uždegiminio proceso reguliavimo sutrikimas; trombocitų agregacija; prokoaguliacinis poveikis Kraujagyslių išsiplėtimas, sukeliantis hipotenziją Intravaskulinė koaguliacija (DIK)

Tromboksanas A2

3 trombocitų faktorius

Neutrofilai Katijoniniai baltymai Stikliųjų ląstelių degranuliacija; kinino sintezė; komplemento aktyvinimas Arterinė hipotenzija; padidėjęs kapiliarų pralaidumas

Kallikrein

Lizosomų fermentai

Hageman faktorius Kinino sistemos aktyvinimas; trombą formuojančių ir fibrinolizinių mechanizmų aktyvavimas Kallikreino ir kininų išsiskyrimas; padidėjęs fibrinogeno suvartojimas Intravaskulinė koaguliacija (DIC sindromas); kraujavimas dėl padidėjusio fibrinogeno vartojimo; arterinė hipotenzija

putplasčio ląstelės, prisotintos cholesterolio esteriais, sukelia aterosklerozinių plokštelių susidarymą, o pakartotinis BoI receptorių egzogeninių ligandų patekimas į kraują ir aktyvus jų endogeninių ligandų išsiskyrimas į kraują streso sąlygomis prisideda prie aterosklerozės progresavimo. Šis požiūris leidžia derinti skirtingas idėjas apie aterogenezės mechanizmus ir vadinamųjų rizikos veiksnių vaidmenį. Nepaisant intensyvaus modelio atpažinimo receptorių ir į Toll panašių receptorių funkcijų tyrimų, procesų, kuriuos sukelia receptorių sąveika su jų ligandais, reguliavimo mechanizmai praktiškai nežinomi. Natūralu, kad dėl to sunku kurti priemones, kurios užkirstų kelią neigiamoms šių receptorių veikimo pasekmėms. Mūsų duomenys rodo, kad pre- ir probiotiniai preparatai gali slopinti sukeliantį LPS poveikį. Pripažįstama, kad padidėjęs cholesterolio kiekis serume yra rizikos veiksnys, susijęs su aterosklerozės ir vainikinių arterijų ligos, pagrindinės mirties priežastimi Vakarų šalyse, išsivystymu. Tokiems ligoniams gydyti vartojama daug cholesterolio kiekį mažinančių vaistų. Tačiau šių junginių, tokių kaip statinai, veikimo taškai sutampa su endotoksinais, sukeldami diametraliai priešingą poveikį, o tai kelia susirūpinimą dėl jų terapinio panaudojimo tam tikrose klinikinėse situacijose. Prebiotikų ir probiotikų vartojimas yra natūralesnis būdas sumažinti cholesterolio kiekį kraujyje žmonėms. Taigi šių vaistų vartojimas turi gana reikšmingą prevencinį hipocholesteroleminį poveikį.

Apibendrinant šiuo metu žinomus duomenis apie aterosklerozės patogenezę, akivaizdu, kad mokslas yra sukaupęs didžiulį kiekį faktų apie įvairių veiksnių įtaką aterosklerozės atsiradimui ir eigai. Plati „aterosklerozės“ sąvoka slepia patologinius procesus su įvairiais mechanizmais. Juos vienija tik galutinis morfologinis substratas kraujagyslių sienelės pažeidimo forma, pasibaigiantis aterosklerozinės plokštelės išsivystymu arba specifiniu kraujagyslės susiaurėjimu.

Kai kurie autoriai „aterosklerozės“ sąvoką dalijasi su „arteriosklerozės“ sąvoka, kuri reiškia arterijų sienelės sukietėjimą dėl intramuralinės fibrozės ir pastarosios kalcifikaciją, susijusį su fiziologiniu senėjimu arba patogeninių veiksnių (pvz., sifilinė arteriosklerozė). Kadangi arteriosklerozė gali išsivystyti besitęsiančios aterosklerozės fone, o pastaroji, savaime suprantama, pasunkins jos vystymąsi, kai kurie autoriai siūlo tokiais atvejais įvesti terminą „arterioaterosklerozė“, reiškiantį šių pažeidimų ryšį su kraujagyslių sienelės pažeidimu. Proceso eigoje. Kiti autoriai, eidami į kitokį kraštutinumą, rekomenduoja aterosklerozę laikyti ypatingu aterosklerozės atveju. Galiausiai užsienio literatūroje sąvokos „aterosklerozė“ ir „arteriosklerozė“ kartais tapatinamos.

Akivaizdu, kad aterosklerozė yra savarankiška liga, kuri atsiranda vidinėje arterijų gleivinėje dėl lipidų prasiskverbimo ir kaupimosi joje ir su tuo susijusių pluoštinių plokštelių susidarymo. Nėra jokios priežasties (patogenetinės, morfologinės ir biocheminės) painioti ir atskirti aterosklerozę su ateroskleroze.

Tam tikrą mechanizmų autonomiškumą įrodo faktas, kad hiperlipidemijos atsiradimas ne visada iš karto sukelia aterosklerozinius kraujagyslių pokyčius. Ir tuo pačiu metu aterosklerozės išsivystymas tam tikromis sąlygomis yra įmanomas be ankstesnės hiperlipidemijos. Tiesa, labiausiai paplitęs faktas yra natūralus priežasties ir pasekmės ryšys tarp hiperlipidemijos ir aterosklerozinio kraujagyslių sienelės pažeidimo, nors jo atsiradimui ir įgyvendinimui reikalingi tam tikri papildomi veiksniai, vienas iš kurių yra gramneigiamų bakterijų endotoksinas – vienas iš aktyviausi ir nuolat veikiantys aterogenezę skatinantys veiksniai. Todėl būtina stebėti endotoksino kiekį kraujyje ir kurti hiperendotoksemijos profilaktikos ir gydymo metodus.

LITERATŪRA

1. Ross R. Aterosklerozės patogenezė: 1990-ųjų perspektyva // Gamta. - 1993. - T. 362. - P. 801-809.

2. Klimovas A.N., Nagornevas V.A. Žvilgsnis į aterosklerozės problemos sprendimą // Vestn. RAMAI. - 1999. - Nr 9. - P. 33-37.

3. Konev Yu.V., Lazebnik L.B. Endotoksino metabolizmas organizme ir jo vaidmuo involiucijos procesuose // Klin. gerontol. - 2009. - T. 15, Nr. 1. - P. 39-46.

4. Konev Yu.V., Kagan L.G., Trubnikova I.A. Vyresnio amžiaus žmonių disbiotiniai procesai žarnyne // Poliklinikos gydytojo vadovas. - 2009. - Nr.3. - P. 44-48.

5. Jakovlevas M.Yu. Žmogaus fiziologijos ir patologijos endotoksinų teorijos elementai // Žmogaus fiziologija. - 2003. - T. 29, Nr. 4. - P. 98-109.

6. Ryabichenko E.V., Bondarenko V.M. Žarnyno bakterinės autofloros ir jos endotoksino vaidmuo žmogaus patologijoje // Žurnalas. mikrobiol. - 2007. - Nr.3. - P. 103-111.

7. Cook D.N., Pisetsky D.S., Schwartz D.A. Į rinkliavas panašūs receptoriai žmogaus ligų patogenezėje // Nature Immunol. - 2004. - T. 5,

Nr. 10. - P. 975-979.

8. Akira S, Sato S. Toll-like receptoriai ir jų signalizacijos mechanizmai // Scand. J. Užkrėsti. Dis. - 2003. - T. 35, Nr. 9. - P. 555-562. Apžvalga.

9. Lykova E.A., Bondarenko V.M., Vorobjovas A.A. ir kt.. Vaikų bakterinė endotoksemija dėl žarnyno disbakteriozės // Žurnalas. mikrobiol. - 1999. - Nr.3. - P. 67-70.

10. Zhang H.Y., Han de W., Su A.R. ir kt. Žarnyno endotoksemija vaidina pagrindinį vaidmenį vystant hepatopulmoninį sindromą žiurkių cirozės modelyje, kurį sukelia keli patogeniniai veiksniai // World J. Gastroenterol. - 2007. - T. 13, 47. - P. 6385-6395.

11. Yokude M, Kita T. Makrofagas ir jo vaidmuo aterogenezėje // Intern. Med. - 1995. - T. 34. - P. 281-283.

12. Erridge C., Stewart J., Poxton I.R. Monocitai, heterozigotiniai dėl Asp299Gly ir Thr399Ile mutacijų Toll-like receptorių 4 gene, nerodo lipopolisacharidų signalizacijos deficito // J. Exp. Med. - 2003. - T. 197. - P. 1787-1791.

13. Majdalawieh A., Ro H.S. LPS sukeltą makrofagų cholesterolio ištekėjimo slopinimą skatina adipocitų stipriklį surišantis baltymas 1 // Int. J. Biochem. Ląstelė. Biol. - 2009. - T. 41, Nr. 7. - P. 1518-1525. Epub 2009 sausio 8 d.

14. Taranto M.P., Perdigon G., MediciM. ir kt. Gyvūnų modelis, skirtas pieno rūgšties bakterijų cholesterolio mažinimui in vivo įvertinti // Methods Mol. Biol. - 2004. - T. 268. - P. 417-422.

15. Jakovlevas M. Yu., Likhoded V. G., Permyakov N. K., Konev Yu.V. Endotoksinų sukeltas endotelio pažeidimas // Arch. patolis. - 1996. - T. 58, Nr. 2. - P. 41-46.

16. Kovalčiukas L.V. Uždegimo doktrina atsižvelgiant į naujus duomenis: idėjų plėtra I. I. Mechnikova // Žurnalas. mikrobiol. - 2008. - Nr.5. - P. 10-15.

17. Liao W. Endotoksinas: galimi vaidmenys inicijuojant ir vystant

aterosklerozė // J. Lab. Clin. Med. - 1996. - T. 128, Nr. 5. - P. 452-460.

18. Ievenas M.M., Hoymansas V.Y. Chlamydia pneumoniae dalyvavimas aterosklerozėje: daugiau įrodymų, kad trūksta įrodymų // J. Clin. Microbiol. - 2005. - T. 43, Nr. 1. - P. 19-24.

19. Rakoff-Wahum S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F. ir kt. Žarnyno homeostazei reikalingas kommensalinės mikrofloros atpažinimas pagal Toll tipo receptorius // Ląstelė. - 2004. - T. 118, Nr. 2. - P. 229-241.

20. Bondarenko V.M., Ginzburg A.L., Likhoded V.G. Infekcinio faktoriaus vaidmuo aterosklerozės patogenezėje // Epidemiol. ir infekcinės ligos. - 2011. - Nr. 1. - P. 7-12.

21. Likhoded V.G., Bondarenko V.M. Mikrobinis faktorius ir į rinkliavas panašūs receptoriai aterosklerozės patogenezėje // Žurnalas. mikrobiol., epidemiol. ir imunobiolis. - 2009. - Nr. 6. - P. 107-112.

22. Satoh M., Shimoda Y., Akatsu T. ir kt. Padidėjęs šilumos šoko baltymo 70 kiekis kraujyje yra susijęs su sistemine uždegimo reakcija per monocitų Toll signalą pacientams, sergantiems širdies nepakankamumu po ūminio miokardo infarkto // Eur. Soc. Kardiolis. - 2006. - T. 8. - P. 810-815.

23. Bondarenko V.M., Likhoded V.G., Jakovlevas M.Yu. Gramneigiamų bakterijų endotoksino nustatymas žmogaus kraujyje // Žurnalas. mikrobiol. - 2002. - Nr.2. - P. 83-89.

24. Likhoded V.G., Konev Yu.V., Trubnikova I.A. ir kt.. Endotoksinų iš gramneigiamų bakterijų aptikimas naudojant elektromagnetinės spinduliuotės dažnių spektrą // Zhurn. mikrobiol., epidemiol. ir imuno-biol. - 2007. - Nr. 3. - P. 3-6.

25. Fraunberger P., Grone E., Grone H.J., Walli A.K. Simvastatinas sumažina endotoksinų sukeltą branduolinio faktoriaus kappaB aktyvaciją ir jūrų kiaulyčių mirtingumą, nepaisant to, kad sumažėja cirkuliuojančio mažo tankio lipoproteinų cholesterolio kiekis // Šokas. - 2009. - T. 32, Nr. 2. - P. 159-163.

26. Bone R.C. SIRS (sisteminio uždegiminio atsako sindromo) epidemiologijos ir natūralios istorijos link // JAMA. - 1992. - T.

268, Nr. 24. - P. 3452-3455.

27. Meakinsas J.L., Maršalas J.C., Carrico Memonas R.F. ir kt. Kelių organų nepakankamumo sindromas // Arch Surg. - 1986. - T. 121, Nr. 2. - P. 196-208.

28. Čižikovas N.A., Likhodedas V.G., Svetukhinas F.B., Jakovlevas M.Ju. Žarnyno mikrofloros endotoksinas apatinių galūnių lėtinės išemijos klinikoje ir patogenezėje. - Penza, 2002. - 169 p.

29. Wiederman C. J., Kiechl S., Dunzendorfer S. ir kt. Endotoksemija ir aterosklerozė // J. Endotox. Res. - 2000. - T. 6, Nr. 2. - P. 86-88.

30. Jakovlevas M.Ju., Anikhovskaja I.A., Meškovas M.V., Jakovleva M.M. Žarnyno endotoksinas reguliuojant hemostazės sistemos veiklą ir DIC sindromo patogenezę // Žmogaus fiziologija. - 2005. - Nr 6. - P. 91-96.

31. Stewart G.J., Anderson M.J. Ultrastruktūrinis endotoksinų sukeltos žalos triušio mezenterinėse arterijose tyrimas // Brit. J. Exp. Pathol. - 1971. - T. 52. - P. 75-80.

32. Atmintinė R.F. ir kt. Endotoksinas, naviko nekrozės faktorius? Ir interleikino-1 sumažėjęs kepenų skvaleno sintazės aktyvumas, baltymų ir mRNR lygis Sirijos žiurkėnams // J. Lipid Res. -1997 m. – t. 38. - P. 1620-1629.

33. Ulevičius R.J. Terapijos taikymas ir įgimta imuninė sistema // Nature Rev. Immunol. - 2002. - T. 4. - P. 512-520.

Bakterijų sintetinamos toksinės medžiagos chemiškai giminingos baltymams (egzotoksinai) ir LPS (endotoksinai) – lokalizuotos sienelėje B!! ir paleidžiami tik juos sunaikinus.

Endotoksinai. Tai yra lipopolisacharidai (LPS), kurie randami gramneigiamų bakterijų ląstelės sienelėje. Nustatomos toksinės savybės visos LPS molekulės , o ne atskiros jo dalys: PS arba lipidas A. Gerai ištirti enterobakterijų (Escherichia, Shigella ir Salmonella, Brucella, tularemijos bakterijų) endotoksinai.

LPS (endotoksinai), skirtingai nei egzotoksinai, yra atsparesni aukštai temperatūrai, mažiau toksiški ir mažiau specifiniai. Sušvirkštus į  eksperimento tiriamuosius F!! sukelti maždaug tą pačią reakciją, neatsižvelgiant į tai, kuri gr–B!! jie yra paryškinti. ĮVEDUS DIDELIAS DOZES, stebimas fagocitozės slopinimas, toksikozės simptomai, silpnumas, dusulys, žarnyno sutrikimas (viduriavimas), sumažėjęs aktyvumas ir ↓ kūno temperatūra. Vartojant MAŽAS DOZES, pasireiškia priešingas poveikis: fagocitozės, kūno temperatūros stimuliavimas.

ŽMONĖMS endotoksinų patekimas į kraują sukelia karščiavimas dėl jų poveikio kraujo ląstelėms (granulocitams, monocitams), iš kurių išsiskiria endogeniniai pirogenai. Anksti leukopenija, kuris pakeičiamas antriniu leukocitozė. Padidėja glikolizė  gali pasireikšti hipoglikemija. Taip pat besivystantis hipotenzija(serotonino ir kininų patekimas į kraują) sutrinka kraujo atsargos organai ir acidozė.

LPS aktyvina komplemento C3 frakciją ALTERNATYVIU KELIU  ↓ jo kiekį serume ir biologiškai aktyvių frakcijų (C3a, C3b, C5a ir kt.) kaupimąsi. Didelis endotoksino kiekis, patekęs į kraują, sukelia TOKSINIS-SEPTINIS ŠOKAS.

LPS yra palyginti silpnas imunogenas. Gyvūnų, imunizuotų grynu endotoksinu, kraujo serumas nepasižymi dideliu antitoksiniu aktyvumu ir negali visiškai neutralizuoti jo toksinių savybių.

Kai kurios bakterijos vienu metu gamina ir baltymų toksinus, ir endotoksinus, pvz., E. coli ir kt.

patogeniškumo fermentai ir antigenai

Patogeniškumo fermentai – tai mikroorganizmų agresijos ir apsaugos veiksniai. Gebėjimas formuoti egzofermentus daugiausia lemia bakterijų invaziškumą – gebėjimą prasiskverbti per gleivinę, jungiamąjį audinį ir kitus barjerus. Tai įvairūs liziniai fermentai – hialuronidazė, kolagenazė, lecitinazė, neuraminidazė, koagulazė, proteazės. Jų charakteristikos plačiau pateikiamos paskaitoje apie mikroorganizmų fiziologiją.

Atsižvelgiama į svarbiausius patogeniškumo veiksnius toksinai , kurias galima suskirstyti į dvi dideles grupes – egzotoksinai ir endotoksinai .

Egzotoksinai patenka į išorinę aplinką (organizmas šeimininkas), dažniausiai baltyminio pobūdžio, gali pasižymėti fermentiniu aktyvumu, juos gali išskirti ir gramteigiamos, ir gramneigiamos bakterijos. Jie turi labai didelį toksiškumą, yra termiškai nestabilūs ir dažnai pasižymi antimetabolitinėmis savybėmis. Egzotoksinai yra labai imunogeniški ir sukelia specifinių neutralizuojančių antikūnų susidarymą.antitoksinų. Pagal veikimo mechanizmą ir taikymo vietą egzotoksinai skiriasi – citotoksinai (enterotoksinai ir dermatonekrotoksinai), membranų toksinai (hemolizinai, leukocidinai), funkciniai blokatoriai (cholerogenai), eksfoliantai ir eritrogeninai. Mikrobai, galintys gaminti egzotoksinus, vadinamiToksiškas.

Endotoksinai išsiskiria tik žūstant bakterijoms, yra būdingi gramneigiamoms bakterijoms ir yra sudėtingi cheminiai ląstelės sienelės junginiai (LPS) – plačiau skaitykite paskaitoje apie bakterijų cheminę sudėtį. Toksiškumą lemia lipidas A, toksinas yra santykinai atsparus karščiui; imunogeninės ir toksinės savybės yra mažiau ryškios nei egzotoksinų.

Kapsulių buvimas bakterijose apsunkina pradines apsauginių reakcijų – atpažinimo ir absorbcijos (fagocitozės) stadijas. Reikšmingas invaziškumo veiksnys yra bakterijų mobilumas, kuris lemia mikrobų prasiskverbimą į ląsteles ir tarpląstelines erdves.

Kontroliuojami patogeniškumo veiksniai:

- chromosomų genai;

- plazmidiniai genai;

- vidutinio klimato fagų įvesti genai.

Biologinis mikroskopas.

Ląstelinės struktūros mikrobų dydis yra 0,2–20 mikronų ir jie lengvai aptinkami imersiniu mikroskopu. Virusai daug kartų mažesni. Didžiausio iš jų, pavyzdžiui, variola viruso, skersmuo yra apie 300 nm, o mažiausio – 20–30 nm. Dėl šios priežasties virusams identifikuoti naudojami elektroniniai mikroskopai.

Mikrobiologiniams tyrimams naudojami šviesos ir elektroniniai mikroskopai; optinės ir elektroninės mikroskopijos metodai.

Optinis mikroskopas. Svarbiausia optinė mikroskopo dalis yra objektyvai, kurie skirstomi į sausuosius ir panardinamuosius.

Sausi lęšiai su santykinai dideliu židinio nuotoliu ir mažu padidinimu yra naudojami tirti mikroorganizmus, kurie yra dideli (daugiau nei 10–20 mikronų), panardinimas(lot. immersio – panardinimas) su židinio nuotoliu – tiriant mažesnius mikrobus.

Mikroskopu panardinamasis objektyvas x90 būtina sąlyga, kad jis būtų panardintas į kedro, persikų arba vazelino aliejų, kurio lūžio rodikliai yra arti stiklelio, ant kurio gaminami preparatai. Tokiu atveju ant preparato krentantis šviesos spindulys neišsisklaido ir, nekeičiant krypties, patenka į panardinamą lęšį. Imersinio mikroskopo skiriamoji geba yra 0,2 mikrono ribose, o maksimalus objekto padidinimas siekia 1350.

Kai naudojate panardinamąjį objektyvą, pirmiausia sucentruokite optinę mikroskopo dalį. Tada kondensatorius pakeliamas į scenos lygį, atidaroma diafragma, įmontuojamas mažo didinimo objektyvas, o matymo laukas apšviečiamas plokščiu veidrodžiu. Aliejaus lašas užlašinamas ant stiklelio su spalvotu preparatu, į kurį, akiai kontroliuojant, atsargiai panardinamas lęšis, tada, pakeldami vamzdelį, jie žiūri į okuliarą ir pirmiausia su makro varžtu, o tada mikrosraigtu nustatomas aiškus objekto vaizdas. Darbo pabaigoje servetėle pašalinkite aliejų nuo priekinio objektyvo lęšio.

Tamsiojo lauko mikroskopija yra atliekamas esant šoniniam apšvietimui ir dažniausiai naudojamas tiriant bakterijų judrumą arba aptinkant patogenines spirochetas, kurių skersmuo gali būti mažesnis nei 0,2 mikrono. Norint gauti ryškų šoninį apšvietimą, įprastas kondensatorius pakeičiamas specialiu paraboloidiniu kondensatoriumi, kuriame apatinio lęšio centrinė dalis yra patamsinta, o šoninis paviršius yra veidrodinis. Šis kondensatorius blokuoja centrinę lygiagretaus spindulių pluošto dalį, sudarydamas tamsų matymo lauką. Kraštiniai spinduliai praeina pro žiedinį plyšį, krenta ant kondensatoriaus šoninio veidrodinio paviršiaus, atsispindi nuo jo ir koncentruojasi jo židinyje. Jei pluošto kelyje nėra dalelių, jis lūžta, nukrenta ant šoninio veidrodžio paviršiaus, atsispindi nuo jo ir išeina iš kondensatoriaus. Kai spindulys savo kelyje susiduria su mikrobais, šviesa atsispindi nuo jų ir patenka į lęšį – ląstelės švyti ryškiai. Kadangi šoniniam apšvietimui reikalingas lygiagretus šviesos pluoštas, naudojamas tik plokščias mikroskopo veidrodis. Paprastai tamsaus lauko tyrimas atliekamas sausoje sistemoje. Šiuo atveju nedidelis medžiagos lašelis uždedamas ant stiklelio ir uždengiamas dengiamuoju stikleliu, neleidžiančiu susidaryti oro burbuliukams.

Fazinis kontrastas ir anoptrinė mikroskopija yra pagrįsti tuo, kad šviesos optinio kelio ilgis bet kurioje medžiagoje priklauso nuo lūžio rodiklio. Ši savybė naudojama skaidrių objektų, pavyzdžiui, mikrobų, vaizdo kontrastui padidinti, t.y., tirti jų vidinės struktūros detales. Šviesos bangos, einančios per optiškai tankesnes objekto sritis, faze atsilieka nuo šviesos bangų, kurios per jas nepraeina. Šiuo atveju šviesos intensyvumas nesikeičia, o keičiasi tik svyravimų fazė, kurios nepagauna akis ir fotografinė plokštelė. Norint padidinti vaizdo kontrastą, faziniai svyravimai naudojant specialią optinę sistemą paverčiami amplitudės svyravimais, kuriuos gerai fiksuoja akis. Narkotikai šviesiame regėjimo lauke tampa kontrastingesni – teigiamas kontrastas; Esant neigiamam fazės kontrastui, šviesus objektas matomas tamsiame fone. Aplink vaizdus dažnai atsiranda aureolė.

Anoptraliniu mikroskopu pasiekiamas didesnis mažo kontrasto gyvų mikrobų (net kai kurių virusų) vaizdų aiškumas. Viena iš svarbiausių jo dalių yra objektyvo lęšis, esantis šalia „išėjimo“ vyzdžio, ant kurio užtepamas suodžių arba vario sluoksnis, sugeriantis ne mažiau kaip 10% šviesos. Dėl šios priežasties matymo lauko fonas įgauna rudą spalvą, mikroskopiniai objektai turi įvairių atspalvių – nuo ​​baltos iki aukso rudos spalvos.

RUSIJOS FEDERACIJOS SVEIKATOS MINISTERIJA

BENDRASIS FARMAKOPĖJOS STRAIPSNIS

Bakterinė OFS.1.2.4.0006.15
endotoksinų Vietoj GF XII, 1 dalis OFS 42-0062-07

Šiame straipsnyje aprašomi bakterinių endotoksinų parenteriniam vartojimui skirtuose vaistuose ir jų gamybai naudojamose farmacinėse medžiagose nustatymo metodai.

Bakterijų endotoksinų kiekis nustatomas naudojant reagentą, kuris yra pasagos krabo kraujo ląstelių (amebocitų) lizatas. Limulus polifemas(LAL reagentas) arba Tachypleus tridentatus (TAL reagentas). LAL reagentas specifiškai reaguoja su bakteriniais endotoksinais. Dėl fermentinės reakcijos vyksta reakcijos mišinio pokytis, proporcingas endotoksino koncentracijai.

Yra trys pagrindiniai metodologiniai šio tyrimo atlikimo būdai: gelio-trombo metodas, pagrįstas gelio susidarymu; drumstumo metodas, pagrįstas reakcijos mišinio drumstumu po substrato, esančio LAL reagente, skilimo; ir chromogeninis metodas, pagrįstas spalvos atsiradimu po sintetinio peptido-chromogeninio komplekso skilimo.

Šiame straipsnyje aprašomi šie šeši testai, pagrįsti aukščiau aprašytais principais:

• – Kokybinis gelio krešulio tyrimas (A metodas);
• – Kiekybinis gelio krešulio tyrimas (B metodas);
• – Turbidimetrinis kinetinis testas (C metodas);
• – Chromogeninis kinetinis testas (D metodas);
• – Chromogeninio pakitimo testas (E metodas);
• – Pabaigos taško turbidimetrinis bandymas (F metodas).

Bandymas atliekamas bet kuriuo iš šešių pateiktų metodų. Kilus abejonėms ar nesutarimams, galutinė išvada daroma remiantis rezultatais, gautais atliekant bandymą A metodu.

Patiekalai ir jų ruošimas

LAL tyrime naudojamuose stikliniuose ir plastikiniuose induose neturi būti bakterijų endotoksinų tokiais kiekiais, kokie buvo nustatyti atliekant tyrimą, ir jie neturi turėti įtakos reakcijos eigai.

Endotoksinų standartai

Atliekant tyrimą gali būti naudojamas endotoksino etaloninis standartas (ECS), kurio aktyvumas nustatytas pagal tarptautinį endotoksino standartą. CSC turi būti suprojektuotas atlikti analizę su tam tikra LAL reagento (arba TAL reagento) partija. CSE tirpinimas ir saugojimas atliekamas pagal gamintojo nurodymus.

LAL reagentas

Būtina naudoti LAL reagentą, skirtą pasirinktam bakterijų endotoksinų nustatymo metodui.

Reagento jautrumas (l) išreiškiamas endotoksino vienetais [EU/ml] ir atitinka mažiausią tarptautinio endotoksino standarto koncentraciją, dėl kurios susidaro tankus gelis, kai reaguoja su tam tikru reagentu (A ir B metodai), arba atitinka iki minimalios vertės taško standartinėje kreivėje (C, D, E ir F metodai).

Liofilizuoto LAL reagento skiedimas ir laikymas atliekamas pagal gamintojo instrukcijas.

Pastaba: LAL reagentas, be endotoksinų, gali reaguoti ir su kai kuriais β-glikanais, todėl galima naudoti specifinį LAL reagentą, kuriame pašalintas su glikanais reaguojantis faktorius G. Taip pat leidžiama naudoti pagalbinius tirpalus, kurie blokuoja faktoriaus G reakcijos sistemą. Tokie reagentai gali būti naudojami endotoksinų nustatymui esant glikanams.

Vanduo LAL testui

Reagentų tirpalams ir tiriamojo vaisto skiedimams ruošti LAL tyrimui naudojamas vanduo. Vanduo, skirtas LAL tyrimui, turi atitikti injekciniam vandeniui keliamus reikalavimus ir tuo pačiu neturi turėti bakterinių endotoksinų tokiais kiekiais, kokie buvo nustatyti atliekant tyrimą.

Mėginio paruošimas

Kiekvienas pasirinktas mėginys yra testuojamas atskirai.

Tiriamajam vaistui ištirpinti ir (arba) praskiesti LAL tyrimui naudojamas vanduo, nebent farmakopėjos monografijoje nurodytas kitas tirpiklis. Bandomojo tirpalo pH turi būti LAL reagento gamintojo nurodytoje ribose, paprastai 6,0–8,0. Jei reikia, pH sureguliuojamas iki norimos vertės rūgšties, bazės tirpalais arba naudojant buferinį tirpalą. Naudojamuose tirpaluose neturi būti bandymo metu nustatytų bakterinių endotoksinų ir jie neturi turėti įtakos reakcijos eigai.

Didžiausias leistinas tiriamojo vaisto skiedimas

Didžiausias leistinas skiedimas (MAD) yra didžiausias tiriamojo vaistinio preparato praskiedimas, kuriam esant galima nustatyti endotoksino koncentraciją, atitinkančią šiam vaistui nustatytą bakterinių endotoksinų ribinę vertę.

Tiriamasis vaistinis preparatas gali būti tiriamas vienu skiedimu arba praskiedimų serijomis, jei galutinis skiedimas neviršija MDR vertės, kuri apskaičiuojama pagal formulę:

« maksimalus bakterijų endotoksinų kiekis— leistinas bakterinių endotoksinų kiekis tiriamajame vaiste, nurodytas farmakopėjos monografijoje;

"tiriamojo tirpalo koncentracija"- vaisto ar veikliosios medžiagos koncentracija, kuriai nurodytas didžiausias bakterijų endotoksinų kiekis

— LAL reagento jautrumas, EU/ml.

Norėdami apskaičiuoti didžiausią bakterijų endotoksinų kiekį, naudokite šią formulę:

K yra slenkstinė bandomojo vaisto pirogeninė dozė, lygi 5 EU/kg per 1 valandą (jei jis pacientui skiriamas bet kokiu parenteriniu būdu, išskyrus intratekalinį). Vartojant vaistą intratekaliai, K yra 0,2 EU/kg;

M – didžiausia terapinė tiriamojo vaisto dozė, suvartota per vieną valandą (išreiškiama mg, ml arba vienetais 1 kg kūno svorio).

Radiofarmaciniams preparatams, leidžiamiems į veną, bakterijų endotoksino riba apskaičiuojama kaip 175/V, kur V yra didžiausia rekomenduojama dozė ml. Radiofarmaciniams preparatams, vartojamiems intratekaliai, bakterijų endotoksinų riba yra 14/V.

Vaistams, kurių dozė skaičiuojama vienam kūno paviršiaus m2 (pavyzdžiui, vaistai nuo vėžio), slenkstinė pirogeninė dozė (K) yra 100 EU/m2.

Gelio krešulio testas (A ir B metodai)

Gelio krešulio metodas leidžia nustatyti endotoksinų buvimą mėginyje arba kiekybiškai įvertinti jų koncentraciją. Dėl LAL reagento reakcijos su endotoksinu reakcijos mišinio klampumas didėja, kol susidaro tankus gelis.

Siekiant užtikrinti testų tikslumą ir patikimumą, reikia patvirtinti nurodytą LAL reagento jautrumą ir patikrinti, ar nėra trukdančių veiksnių, kaip aprašyta skyriuje. „Preliminarios analizės“.

Bandymo procedūra

Į 10 mm skersmens apvaliadugnius mėgintuvėlius įpilami vienodi tūriai tiriamojo tirpalo ir LAL reagento (po 0,1 ml). Reakcijos mišiniai švelniai sumaišomi ir inkubuojami 37 ± 1 °C temperatūroje 60 ± 2 minutes. Inkubacijos metu reikia vengti vibracijos ir smūgio. Po nurodyto laikotarpio rezultatai vizualiai užfiksuojami kaip teigiami arba neigiami. Teigiama reakcija (+) pasižymi tankaus gelio susidarymu, kuris nesuyra, kai vamzdis vieną kartą atsargiai pasukamas 180°. Neigiama reakcija (–) pasižymi tokio gelio nebuvimu.

IŠANKSTINĖ ANALIZĖ

LAL reagento deklaruoto jautrumo patvirtinimas

Analizė atliekama kiekvienai naujai naudojamo LAL reagento serijai, taip pat keičiant eksperimento sąlygas, naudojamas medžiagas ir reagentus, kurie gali turėti įtakos bandymo rezultatams.

Procedūra bandymai

C ir D tirpalai pagal 1 lentelėje pateiktą schemą.

1 lentelė - Eksperimento schema "

Sprendimai C– CSE skiedimų vandenyje serija, skirta LAL tyrimui (LAL reagento jautrumo tikrinimui);

Sprendimas D

Eksperimentas atliekamas taip, kaip aprašyta skyriuje " Analizės procedūra“.

Rezultatai ir interpretacija

• - Dėl sprendimas D(neigiama kontrolė) neigiami rezultatai gauti visuose pakartojimuose;
• - Dėl sprendimas C esant 2l koncentracijai gauti teigiami rezultatai;
• - Dėl sprendimas C esant 0,25l koncentracijai gauti neigiami rezultatai.

Kiekvieno pakartojimo reakcijos pabaigos taškas sprendimas C yra teigiamas rezultatas, gautas tirpalui su mažiausia CSE koncentracija. Remiantis šiais rezultatais, pagal šią formulę apskaičiuojama LAL reagento jautrumo geometrinė vidutinė vertė:

Kur:

– CSE koncentracijų logaritmų suma reakcijos pabaigos taške kiekviename iš pakartojimų;

f– pakartojimų skaičius.

Deklaruojamas LAL reagento jautrumas laikomas patvirtintu ir naudojamas tolesniuose skaičiavimuose, jei eksperimento metu gauta LAL reagento jautrumo reikšmė yra ne mažesnė kaip 0,5 ir ne didesnė kaip 2.

Trukdantys veiksniai

Tiriamasis vaistas gali turėti trukdančių faktorių, kurie sustiprina ir (arba) slopina LAL reagento reakciją su bakteriniais endotoksinais. Šiuos reiškinius galima aptikti lyginant LAL reagento, naudojamo LAL testui, gebėjimą reaguoti su CSE tirpalu vandenyje ir bandomojo vaisto tirpale standartinėmis eksperimentinėmis sąlygomis.

Vaistas gali būti tiriamas bet kokiu praskiedimu, neviršijančiu MDR vertės. Šioje analizėje naudojamuose tiriamojo vaistinio preparato (ar jo skiedimų) mėginiuose neturi būti bakterinių endotoksinų tokiu kiekiu, kuris buvo nustatytas atliekant tyrimą.

Bandymo procedūra

Analizei atlikti paruoškite tirpalus A – D pagal 2 lentelėje pateiktą schemą.

Sprendimas A– tiriamasis vaistas pasirinktu skiedimu (stebėti, ar nėra bakterinių endotoksinų);

Sprendimai B– CSE skiedimų serija tiriamojo vaisto tirpale (nurodoma galimybė slopinti arba sustiprinti reakciją);

Sprendimai C– CSE praskiedimų vandenyje serija LAL testui (teigiama kontrolė);

SprendimasD– vanduo LAL testui (neigiama kontrolė).

2 lentelė. Eksperimento „Trikdantys veiksniai“ schema

Rezultatai ir interpretacija

Eksperimento rezultatai laikomi patikimais, jei: Eksperimentas atliekamas taip, kaip aprašyta skyriuje " Analizės procedūra“.

– Dėl sprendimai A Ir D neigiami rezultatai gauti visuose pakartojimuose;

- Dėl sprendimai C(teigiama kontrolė) bakterijų endotoksinų koncentracijos geometrinis vidurkis yra ne mažesnis kaip 0,5 ir ne didesnis kaip 2.

Remiantis kiekvieno kartojimo rezultatais sprendimai B, apskaičiuokite LAL reagento jautrumo geometrinį vidurkį. Skaičiavimas atliekamas taip, kaip aprašyta skyriuje " LAL reagento deklaruoto jautrumo patvirtinimas". Jei gauta vidutinė vertė yra ne mažesnė nei 0,5 l ir ne didesnė kaip 2 l, laikoma, kad įrodyta, kad pasirinktame skiedime tiriamasis vaistas neturi trukdančių faktorių, galinčių slopinti ir (arba) sustiprinti LAL reagento reakciją su bakteriniais endotoksinais. ir gali būti analizuojamas bakterijų endotoksinų kiekis.

Jei tiriamajam vaistui, kuris buvo tiriamas mažesniu nei MDI praskiedimu, nustatomas trukdančių veiksnių, bandymas kartojamas didesniu praskiedimu iki praskiedimo, lygaus MDI. Daugeliu atvejų papildomas tiriamojo vaisto praskiedimas gali pašalinti trukdančių veiksnių poveikį. Naudojant didesnio jautrumo LAL reagentą, galima padidinti praskiedimo laipsnį.

Trukdančius veiksnius galima įveikti tinkamai paruošiant mėginį, pvz., filtruojant, neutralizuojant, dializuojant arba apdorojant temperatūra. Pasirinktas trukdančių faktorių šalinimo būdas neturi keisti bakterijų endotoksinų koncentracijos tiriamajame vaiste, todėl prieš tokį apdorojimą į tiriamojo vaisto tirpalą pridedama žinomos koncentracijos CSE, po kurios atliekama analizė. Trukdantys veiksniai". Jei po apdorojimo pasirinktu metodu analizės rezultatai yra patenkinami, tada tiriamajame vaistiniame preparate galima atlikti bakterinių endotoksinų kiekio analizę.

Jei tiriamojo vaistinio preparato negalima pašalinti nuo trukdančių veiksnių, jo negalima tirti dėl bakterinių endotoksinų naudojant LAL testą.

KOKYBINĖ ANALIZĖ (A metodas)

Šios analizės tikslas – patvirtinti, kad bakterijų endotoksinų kiekis tiriamajame mėginyje neviršija farmakopėjos monografijoje nurodytos bakterijų endotoksinų ribinės vertės.

Bandymo procedūra

Pasiruoškite analizei Sprendimai A –D pagal schemą, parodytą 3 lentelėje.

Sprendimas A– tiriamasis vaistas praskiedus, kuriame nėra trukdančių faktorių, arba didesniu praskiedimu, neviršijančiu MDR;

Sprendimas B– tiriamasis vaistas pasirinktu skiedimu, į kurį pridedama CSE. Galutinė endotoksino koncentracija tiriamajame tirpale turi būti 2 (teigiama tiriamojo mėginio kontrolė).

Sprendimas C– CSE tirpalas vandenyje LAL bandymui, kurio galutinė koncentracija yra 2 (teigiama kontrolė).

SprendimasD– vanduo LAL testui (neigiama kontrolė).

Tyrimas atliekamas taip, kaip aprašyta skyriuje Tyrimo procedūra.

3 lentelė - Eksperimento „Kokybinė analizė“ schema

Rezultatai ir interpretacija

Analizė laikoma patikima, jei:

- Dėl sprendimasD(neigiama kontrolė) buvo gauti neigiami rezultatai abiejuose pakartojimuose,

- Dėl sprendimas C(teigiama kontrolė) visuose pakartojimuose gauti teigiami rezultatai,

- Dėl sprendimas B(teigiama tiriamojo mėginio kontrolė) abiejuose kartojiniuose buvo gauti teigiami rezultatai.

Jei už sprendimas A Neigiami rezultatai gauti per du pakartojimus, laikoma, kad vaistas išlaikė testą.

Jei bandomajam vaistui gauti teigiami rezultatai praskiedus mažiau nei MRT dviem egzemplioriais, bandymas turi būti kartojamas didesniu praskiedimu arba skiedimu, lygiu MRT.

Jei tiriamajam vaistui gauti teigiami rezultatai, kai skiedimas lygus MDR dviem pakartojimais, vadinasi, vaistas neatitinka farmakopėjos monografijos skyriaus „Bakteriniai endotoksinai“ reikalavimų.

Jei viename iš pakartojimų gaunamas teigiamas rezultatas sprendimas A, tada analizė kartojama. Laikoma, kad vaistinis preparatas išlaikė testą, jei atliekant pakartotinę analizę du kartus gaunami neigiami rezultatai.

KIEKYBINĖ ANALIZĖ (B metodas)

Šiuo metodu bakterijų endotoksinų kiekis nustatomas naudojant bandomojo vaisto serijinius skiedimus.

Bandymo procedūra

Pasiruoškite analizei A–D sprendimai pagal schemą, parodytą 4 lentelėje.

Sprendimai A– tiriamojo vaisto skiedimas, pradedant nuo praskiedimo, kuriame nėra trukdančių faktorių, iki didžiausio praskiedimo, neviršijančio MDR.

Sprendimas B– mažiausias skiedimas iš A tirpalo, į kurį pridedama CSE tirpalo, serijos. Galutinė endotoksino koncentracija tiriamajame tirpale turi būti 2 (teigiama tiriamojo mėginio kontrolė).

Sprendimai C– CSE praskiedimų vandenyje serija LAL testui (teigiama kontrolė).

Sprendimas D– vanduo LAL testui (neigiama kontrolė).

Analizė atliekama taip, kaip aprašyta skyriuje " Analizės procedūra“.

4 lentelė — Eksperimento „Kiekybinė analizė“ schema

Rezultatai ir interpretacija

Analizė laikoma patikima, jei:

- Dėl sprendimasD(neigiama kontrolė) neigiami rezultatai gauti dviem egzemplioriais,

- Dėl sprendimai C(teigiama kontrolė) bakterijų endotoksinų koncentracijos geometrinis vidurkis yra ne mažesnis kaip 0,5 ir ne didesnis kaip 2.

- Dėl sprendimas B(teigiama tiriamojo mėginio kontrolė) buvo gauti teigiami rezultatai dviem egzemplioriais,

Dėl sprendimai A Reakcijos galutinis taškas yra teigiamas rezultatas, gautas didžiausiam tiriamojo vaisto praskiedimui.

Šio praskiedimo koeficiento sandauga pagal LAL reagento jautrumą (l) yra lygi endotoksino koncentracijai sprendimas A, gautas tam tikram pakartojimui. Endotoksino koncentracijos geometrinis vidurkis apskaičiuojamas taip, kaip aprašyta skyriuje " LAL reagento deklaruoto jautrumo patvirtinimas".

Jei visuose serijos pasikartojimuose sprendimai A Jei gaunami neigiami rezultatai, tai bakterijų endotoksinų koncentracija tiriamajame vaiste yra mažesnė nei LAL reagento jautrumo ir mažiausio praskiedimo koeficiento sandauga. Jei visuose serijos pasikartojimuose sprendimai A Jei gaunami teigiami rezultatai, tai bakterijų endotoksinų koncentracija tiriamajame vaiste yra didesnė nei LAL reagento jautrumo ir didžiausio praskiedimo koeficiento sandauga.

Laikoma, kad vaistinis preparatas išlaikė testą, jeigu eksperimento metu nustatyta vidutinė bakterinių endotoksinų kiekio vertė yra mažesnė už farmakopėjos monografijoje nurodytą maksimalaus bakterinių endotoksinų kiekio vertę. .

FOTOMETRINĖS METODAI (MethodsC, D, EIrF) TURBIDIMETRINIAI METODAI (CIrF)

Turbidimetriniai metodai yra fotometriniai metodai, pagrįsti reakcijos mišinio drumstumo laipsnio matavimu. Priklausomai nuo bandymo principo, šis metodas gali būti atliktas kaip baigties turbidimetrinis bandymas arba kaip turbidimetrinė kinetinė analizė.

Galutinis turbidimetrinis testas (F metodas) pagrįstas reakcijos mišinio drumstumo laipsnio matavimu inkubacijos laikotarpio pabaigoje, kuris priklauso nuo endotoksino koncentracijos.

Turbidimetrinis kinetinis bandymas (C metodas) pagrįstas reakcijos mišinio drumstumo vystymosi greičio nustatymu, išmatuotu pagal laiką, reikalingą tam tikrai optinio tankio vertei pasiekti.

Chromogeniniai METODAI (D ir E)

Chromogeniniais metodais matuojamas chromoforo kiekis, išsiskiriantis iš chromogeninio substrato dėl endotoksinų reakcijos su LAL reagentu. Priklausomai nuo bandymo principo, šis metodas gali būti atliekamas kaip chromogeninio galutinio taško bandymas arba kaip chromogeninis kinetinis tyrimas.

Chromogeninio galutinio taško testas (E metodas) pagrįstas reakcijos mišinio spalvos intensyvumo matavimu, kuris priklauso nuo chromoforo kiekio, išsiskiriančio inkubacijos laikotarpio pabaigoje. Išsiskiriančio chromoforo kiekis priklauso nuo endotoksino koncentracijos.

Bandymo metu taikant chromogeninį kinetinį metodą (D metodas) nustatomas reakcijos mišinio spalvos vystymosi greitis, matuojamas pagal laiką, kurio reikia tam tikrai reakcijos mišinio optinio tankio vertei pasiekti.

Bandymas atliekamas inkubavimo temperatūroje, kurią rekomenduoja LAL reagento gamintojas (dažniausiai 37 ± 1 °C).

IŠANKSTINĖ ANALIZĖ

Norint patvirtinti tyrimo, naudojant turbidimetrinį arba chromogeninį metodą, patikimumą ir tikslumą, atliekamos išankstinės analizės, užtikrinančios, kad standartinės kreivės kriterijai galioja, o tiriamajame tirpale nėra faktorių, trukdančių reakcijai.

Atliekant bet kokius pakeitimus, galinčius turėti įtakos eksperimento rezultatams, būtinas papildomas bandymo patikimumo ir tikslumo patvirtinimas.

Standartinės kreivės kriterijų patvirtinimas

Analizė atliekama kiekvienai naujai LAL reagento serijai.

Norint sudaryti standartinę kreivę, pagal LAL reagento gamintojo rekomendacijas iš pradinio CSE tirpalo paruošiamos mažiausiai trys skirtingos koncentracijos endotoksinas. Analizė atliekama bent trimis egzemplioriais LAL reagento gamintojo nurodytomis sąlygomis (tūrio santykiai, inkubacijos laikas, temperatūra, pH ir kt.).

Jei taikant kinetinius metodus reikia sudaryti standartinę kreivę su CSE intervalu, viršijančiu 2 lg endotoksino koncentracijos kiekvienam matavimo diapazono pokyčiui endotoksino koncentracijos lg, būtina į eksperimentinį tyrimą įtraukti atitinkamos koncentracijos CSE tirpalą. dizainas.

Išbandytam endotoksinų koncentracijų diapazonui – absoliuti koreliacijos koeficiento vertė |r| turi būti lygus arba didesnis nei 0,980.

Trukdantys veiksniai

Vaistas gali būti tiriamas bet kokiu praskiedimu, neviršijančiu MDR vertės.

Bandymo procedūra

Paruoškite tirpalus A – D, kaip nurodyta 5 lentelėje. Tirpalų A, B, C ir D tyrimai atliekami bent dviem egzemplioriais, vadovaujantis LAL reagento gamintojo rekomendacijomis (tiriamojo vaisto tūrių ir tūrių santykiais). ir LAL reagentas, inkubacijos laikas, temperatūra, pH ir kt.).

5 lentelė - Eksperimento „Trikdantys veiksniai“ schema

Sprendimas A- tiriamojo vaisto tirpalas neviršijančiame MDR reikšmės;

Sprendimas B- tiriamasis vaistas pasirinktu skiedimu, į kurį pridedama CSE. Galutinė endotoksino koncentracija tiriamajame tirpale turi atitikti arba būti artima vidutinei CSE koncentracijos vertei, naudotai standartinei kreivei sudaryti (teigiamas kontrolinis bandomasis mėginys);

Sprendimai C- CSE tirpalai, naudojami standartinei kreivei sudaryti tomis pačiomis koncentracijomis, kurios buvo naudojamos atliekant analizę „Standartinės kreivės kriterijų patvirtinimas“ (teigiama kontrolė);

D tirpalas – vanduo LAL testui (neigiama kontrolė).

– standartinei kreivei gauti rezultatai (sprendimas C) atitinka patikimumo reikalavimus, nustatytus skyriuje „Standartinės kreivės kriterijų patikimumo tikrinimas“;

– D tirpalo (neigiama kontrolė) gautas rezultatas neviršija naudoto LAL reagento instrukcijose nurodytos reikšmės arba mažesnė už endotoksino koncentraciją, nustatytą taikytu metodu.

Vidutinė pridėto endotoksino koncentracijos vertė, gauta eksperimento metu, apskaičiuojama ją atimant iš vidutinės endotoksino koncentracijos vertės sprendimas B(sudėtyje yra pridėta endotoksino) vidutinė endotoksino koncentracija sprendimas A(jei galima).

Laikoma, kad įrodyta, kad tiriamajame tirpale nėra trukdančių faktorių, jei bandymo sąlygomis išmatuota į bandomąjį tirpalą įdėto endotoksino koncentracija yra 50–200 % žinomos pridėto endotoksino koncentracijos.

Jei eksperimentiškai nustatyta endotoksino koncentracija nepatenka į nurodytas ribas, daroma išvada, kad tiriamajame vaiste yra faktorių, trukdančių reakcijai. Tokiu atveju eksperimentą galima pakartoti naudojant didesnį praskiedimą, iki skiedimo, lygaus MWP. Be didesnio tiriamojo vaisto praskiedimo, trukdančių veiksnių įtaką galima įveikti tinkamai gydant, pvz., filtravimu, neutralizavimu, dialize ar temperatūra. Pasirinktas trukdančių faktorių pašalinimo metodas neturėtų lemti bakterinių endotoksinų koncentracijos tiriamajame vaiste mažėjimo, todėl prieš atliekant tokį apdorojimą į tiriamąjį tirpalą pirmiausia reikia įpilti žinomos koncentracijos CSE tirpalo, o po to „Trikdančių veiksnių“ analizė turėtų būti kartojama. Jei po apdorojimo pasirinktu metodu analizės rezultatai yra patenkinami, tada tiriamajame vaistiniame preparate galima atlikti bakterinių endotoksinų kiekio analizę.

Testo atlikimas

Bandymo procedūra

Bandymas atliekamas pagal metodiką, pateiktą skyriuje „Trikdantys veiksniai“.

rezultatus

Dėl sprendimas A kiekviename pakartojime endotoksino koncentracija nustatoma naudojant standartinę kreivę, gautą iš kelių CSE skiedimų ( Sprendimas C).

Bandymas laikomas patikimu, jei tenkinamos šios sąlygos:

1. rezultatai gauti standartinei kreivei ( Sprendimai C), atitinka „skiltyje“ nustatytus patikimumo reikalavimus. Standartinės kreivės kriterijų pagrįstumo tikrinimas»;
2. eksperimentiškai nustatyta endotoksino koncentracija sprendimas B atėmus endotoksinų koncentracijos vertę, nustatytą sprendimas A, yra intervale nuo 50 iki 200 % žinomos vertės;
3. gautas rezultatas sprendimas D(neigiama kontrolė), neviršija naudoto LAL reagento instrukcijose nurodytos reikšmės arba mažesnė už endotoksino koncentraciją, nustatytą taikytu metodu.

Rezultatų interpretacija

Laikoma, kad vaistinis preparatas išlaikė testą, jei eksperimento metu nustatyta vidutinė bakterinių endotoksinų kiekio vertė kartotiniuose tyrimuose. sprendimas A(atsižvelgiant į tiriamojo vaisto skiedimą ir koncentraciją) yra mažesnis už didžiausią bakterijų endotoksinų kiekį, nurodytą farmakopėjos monografijoje.

Pastaba: endotoksino etaloninis standartas ir LAL reagentas arba TAL reagentas turi būti užregistruoti Rusijos Federacijos sveikatos ministerijoje.

GPM.1.2.4.0006.15 Bakteriniai endotoksinai

Rusijos Federacijos sveikatos apsaugos ministerija

Bendroji farmakopėja monografija

Bakteriniai endotoksinai GPM.1.2.4.0006.15
Pakeičia Rusijos Federacijos valstybinės farmakopėjos XII 1 dalies monografiją, GPM 42-0062-07

Šioje Bendrosios farmakopėjos monografijoje aprašomi metodai, naudojami aptikti bakterinius endotoksinus vaistuose, skirtuose tėvams vartoti, ir vaistinėse medžiagose, naudojamose tokiems produktams gaminti.

Bakterijų endotoksinų tyrimas atliekamas naudojant reagentą, kuris pateikia kraujo ląstelių (amoebocitų) lizatą iš pasagos krabo: Limulus polyphemus (LAL reagentas) arba Tachypleus tridentatus (TAL reagentas). LAL reagentai specifiškai sąveikauja su bakteriniais endotoksinais. Dėl fermentinės reakcijos reagento mišinys keičiasi proporcingai endotoksino koncentracijai.

Yra trys pagrindiniai metodologiniai šio testo atlikimo būdai: gelio krešulio tyrimas, pagrįstas gelio susidarymu; drumstumo principas, pagal kurį reaguojančių medžiagų mišinys tampa drumstas po to, kai LAL reagente yra substratas; ir chromogeninis principas, pagrįstas spalva, kurią sukelia sintetinio peptido – chromogeninio komplekso degradacija.

Šioje Farmakopėjos monografijoje aprašomi šie šeši testai, pagrįsti pirmiau minėtais principais:

– Kokybinis gelio krešulio tyrimas (A metodas);

– Kiekybinis gelio krešulio tyrimas (B metodas);

– Turbidimetrinis kinetinis testas (C metodas);

– Chromogeninis kinetinis testas (D metodas);

– Chromogeninio galutinio taško tyrimas (E metodas);

– Turbidimetrinis galutinio taško tyrimas (F metodas).

Bandymas gali būti atliekamas naudojant bet kurį iš šešių pirmiau minėtų metodų. Kilus abejonėms ar neatitikimams, galutinė išvada turėtų būti padaryta remiantis A metodu gautais rezultatais.

Laboratoriniai indai ir jų paruošimas

Stikliniuose ir plastikiniuose laboratoriniuose induose, naudojamuose atliekant LAL testą, neturėtų būti tokio kiekio bakterijų endotoksinų, koks buvo nustatytas atliekant šį tyrimą, ir neturėtų turėti įtakos reakcijos eigai.

Rekomenduojamas depirogenavimo režimas yra kaitinimas 250 °C temperatūroje mažiausiai 30 minučių pagal patvirtintą procedūrą.

Endotoksinų standartai

Bakterijų endotoksinų kiekis išreiškiamas tarptautinio endotoksinų standarto endotoksino vienetais (ES). Vienas tarptautinis endotoksino vienetas (TV) atitinka vieną ES.

Analizė taip pat gali būti pagrįsta endotoksino etaloniniu standartu (ERS); jos veikla nustatyta pagal Tarptautinį endotoksinų standartą. Tam tikros LAL reagento (TAL reagento) partijos tyrimui turėtų būti sukurtas endotoksino etaloninis standartas. ERS tirpinimas ir saugojimas atliekamas pagal gamintojo naudojimo instrukcijas.

LAL reagentas

Turėtų būti naudojamas LAL reagentas, skirtas pasirinktam bakterijų endotoksinų tyrimo metodui.

LAL reagento jautrumas (λ) išreiškiamas endotoksino vienetais ir atitinka minimalią tarptautinio endotoksino standarto koncentraciją, kuri skatina tankaus gelio susidarymą reaguojant su konkrečiu LAL reagentu (A ir B metodai) arba atitinka mažiausią vertę. standartinės kreivės taškas (C, D, E ir F metodai).

Liofilizuoto LAL reagento tirpinimas ir saugojimas atliekamas pagal gamintojo naudojimo instrukcijas.

Pastaba: Be endotoksinų, LAL reagentas taip pat gali reaguoti su kai kuriaisβ -glikanai, todėl gali būti naudojamas specifinis LAL reagentas be G faktoriaus, kuris reaguoja su glikanais. Taip pat leidžiama naudoti papildomus sprendimus, kurie blokuoja G faktoriaus reaguojančią sistemą. Šie reagentai gali būti naudojami endotoksinams, esant glikanams, nustatyti.

Vanduo LAL tyrimams

Vanduo LAL tyrimams naudojamas ruošiant visus tiriamojo vaistinio preparato reagentus ir skiedimus. Vanduo, skirtas LAL tyrimams, turi atitikti reikalavimus, nustatytus injekciniam vandeniui, ir jame neturi būti bakterinių endotoksinų tiek, kiek galima nustatyti atliekant tyrimą.

Tirto pavyzdžio paruošimas

Kiekvienas pasirinktas mėginys turi būti tiriamas atskirai.

Vanduo, skirtas LAL tyrimams, naudojamas tiriamam vaistiniam preparatui ištirpinti ir (arba) praskiesti, jei Farmakopėjos monografijoje nenurodyta kitaip. Tiriamo tirpalo pH vertė turi būti LAL reagento gamintojo nurodytose ribose, dažniausiai 6,0 – 8,0. Jei reikia, tiriamo tirpalo pH koreguojamas naudojant rūgštinius arba bazinius tirpalus arba buferinį tirpalą. Naudojamuose tirpaluose neturi būti bakterinių endotoksinų tiek, kiek galima aptikti atliekant bandymą, ir jie neturėtų turėti įtakos reakcijos eigai.

Didžiausias priimtinas tiriamo vaistinio preparato skiedimas

Didžiausias priimtinas skiedimas (MAD) – tai didžiausias tiriamo vaistinio preparato skiedimas, kuriame galima nustatyti endotoksinų koncentraciją, atitinkančią didžiausią bakterinių endotoksinų kiekį, patvirtintą konkrečiam vaistui.

Tiriamasis vaistinis preparatas gali būti tiriamas vienu skiedimu arba skiedimų serija, jei galutinis skiedimas neviršija MAD vertės, kuri apskaičiuojama pagal šią lygtį:

kur: " maksimalus bakterijų endotoksinų kiekis” – tai leistinas bakterinių endotoksinų kiekis tiriamame vaiste, nurodytas Farmakopėjos monografijoje;

“tiriamo tirpalo koncentracija” – tai vaistinio preparato ar veikliosios medžiagos koncentracija, kuriai nustatytas didžiausias bakterinių endotoksinų kiekis;

λ yra LAL reagento jautrumas (EU/mL).

Didžiausiam bakterijų endotoksinų kiekiui apskaičiuoti naudojama ši lygtis:

čia: K – tiriamo vaistinio preparato slenkstinė pirogeninė dozė, lygi 5 EU/kg per valandą (jei pastarasis pacientams skiriamas bet kokiu parenteriniu būdu, išskyrus intratekalinį). Jei vaistas vartojamas intratekaliniu būdu, K reikšmė yra 0,2 EU/kg;

M – didžiausia terapinė tiriamo vaistinio preparato dozė, suvartota per vieną valandą (išreiškiama mg, ml arba vienetais 1 kg kūno svorio).

Į veną leidžiamų radiofarmacinių vaistinių preparatų didžiausias bakterijų endotoksinų kiekis apskaičiuojamas kaip 175/V, kur V yra didžiausia rekomenduojama dozė (ml). Radiofarmacinių vaistinių preparatų, vartojamų intratekaliai, didžiausias bakterijų endotoksinų kiekis apskaičiuojamas kaip 14/V.

Jei vaistinio preparato dozės išreiškiamos vienam kūno paviršiaus ploto kvadratiniam metrui (pvz., vaistai nuo navikų), pirogeninės dozės (K) slenkstis yra 100 EU/m 2 .

Gelio krešulio tyrimas (metodaiAirIN)

Gelio krešulio metodas leidžia aptikti arba kiekybiškai įvertinti endotoksinus mėginyje. Dėl reakcijos tarp LAL reagento ir endotoksino padidėja reakcijos mišinio klampumas, kol susidaro tankus gelis.

Siekiant užtikrinti tyrimo rezultatų tikslumą ir patikimumą, reikia patikrinti nurodytą LAL reagento jautrumą ir atlikti trukdančių faktorių buvimo testą, kaip aprašyta „ Parengiamasis bandymas" skyrius .

Procedūros aprašymas. Perpilkite vienodus kiekius tiriamo tirpalo ir LAL reagento (kiekvieno po 0,1 ml) į 10 mm skersmens apvaliadugnius mėgintuvėlius. Reakcijos mišiniai atsargiai sumaišomi ir inkubuojami 37 ± 1 °C temperatūroje 60 ± 2 minutes. Inkubacijos metu reikia vengti vibracijos ir mechaninių smūgių. Pasibaigus nurodytam laikui, rezultatai vizualinio tyrimo metu įvertinami kaip teigiami arba neigiami. Teigiama reakcija (+) pasižymi tankaus gelio susidarymu, kurio nesunaikina vienas atsargus mėgintuvėlio pasukimas 180°. Neigiama reakcija (-) pasižymi tokio gelio nebuvimu.

PARENGIMASIS BANDYMAS

Ši analizė atliekama kiekvienai naujai panaudoto LAL reagento partijai, taip pat pasikeitus eksperimento sąlygoms, naudotoms medžiagoms ir reagentams, kurie gali turėti įtakos bandymo rezultatams.

Procedūros aprašymas. Šiam bandymui C ir D tirpalai ruošiami pagal 1 lentelės reikalavimus.

1 lentelė – Eksperimento planas, „Teigiamas LAL reagento jautrumo patvirtinimas“

The Sprendimai C seriją sudaro ERS skiedimai vandenyje, skirti LAL testavimui (LAL reagento jautrumo patikra);

Sprendimas D

Bandymas atliekamas taip, kaip aprašyta skyriuje „Procedūros aprašymas“.

Rezultatai ir interpretacija Analizė laikoma tinkama, jei įvykdomos šios sąlygos:

- dėl Sprendimas D(neigiama kontrolė) – neigiami rezultatai gaunami visuose kartotiniuose bandymuose;

- dėl Sprendimas C esant 2λ koncentracijai – gaunami teigiami rezultatai;

- dėl Sprendimas C esant 0,25λ koncentracijai – gaunami neigiami rezultatai.

Kiekvienos replikos reakcijos pabaigos taškas Sprendimai C serija yra teigiamas rezultatas, gautas tirpalui su mažiausia ERS koncentracija. Šie rezultatai naudojami LAL reagento jautrumo geometrinei vidutinei vertei apskaičiuoti; apskaičiavimas atliekamas pagal šią lygtį:

Geometrinis ERS koncentracijų vidurkis reakcijos galutiniame taške

=

antilogas (),

čia: e yra ERS koncentracijų logaritmų suma reakcijos galutiniuose taškuose kiekviename pakartojime;

f yra pakartojimų skaičius.

Nurodytas jautrumas LAL reagentui laikomas patvirtintu ir gali būti naudojamas vėlesniuose skaičiavimuose, jei bandymo metu gauta LAL reagento jautrumo vertė yra ne mažesnė nei 0,5 λ ir neviršija 2 λ.

Trukdantys veiksniai

Tiriamas vaistinis preparatas gali turėti trukdančių faktorių, sustiprinančių ir (arba) slopinančių LAL reagento reakciją su bakteriniais endotoksinais. Šiuos įvykius galima atpažinti palyginus panaudoto LAL reagento gebėjimą reaguoti su ERS tirpalu vandenyje LAL testavimui ir bandomo vaistinio preparato tirpale standartinėmis eksperimentinėmis sąlygomis.

Vaistas gali būti tiriamas bet kokiu praskiedimu, neviršijančiu MAD vertės. Atliekant šią analizę naudojamuose tiriamojo vaistinio preparato (ar jo skiedimo) mėginiuose neturėtų būti bakterinių endotoksinų tiek, kiek galima aptikti atliekant tyrimą.

Procedūros aprašymas . Šiai analizei tirpalai A – D ruošiami pagal 2 lentelėje pateiktus reikalavimus.

Sprendimas A– tiriamas vaistinis preparatas pasirinktu skiedimu (bakterinių endotoksinų nebuvimo kontrolė).

Sprendimai B– ERS skiedimų serija tiriamo vaistinio preparato tirpale (testas, nustatantis reakcijos slopinimo ar sustiprėjimo galimybę).

Sprendimai C

Sprendimas D– Vanduo LAL testavimui (neigiama kontrolė).

2 lentelė –

Šis bandymas turi būti atliktas taip, kaip aprašyta „ Procedūros aprašymas" skyrius.

Rezultatai ir interpretacija. Bandymas gali būti laikomas patikimu, jei tenkinamos šios sąlygos:

• dėl A ir D sprendimai— visuose pakartojimuose gauti neigiami rezultatai;
• dėl Sprendimai C(teigiama kontrolė) – bakterijų endotoksinų koncentracijos geometrinis vidurkis turi būti ne mažesnis kaip 0,5λ ir ne didesnis kaip 2λ.

Rezultatai, gauti kiekvienoje kopijoje Sprendimai B serijos naudojamos LAL reagento jautrumo geometrinei vidutinei vertei apskaičiuoti. Skaičiavimas atliekamas taip, kaip aprašyta " Nurodyto LAL reagento jautrumo patvirtinimas" skyrius. Jei gauta vidutinė jautrumo reikšmė yra ne mažesnė kaip 0,5λ ir ne didesnė kaip 2λ, tai reiškia, kad tiriamame vaistiniame preparate konkrečiame praskiedime nėra jokių trukdančių faktorių, galinčių slopinti ir (arba) sustiprinti LAL reagento reakciją. su bakteriniais endotoksinais, todėl gali būti analizuojamas bakterijų endotoksinų kiekis.

Jei buvo įrodyta, kad tirtam vaistui, analizuojamam praskiedimui, mažesniam nei MAD, yra trukdančių faktorių, bandymas turi būti kartojamas didesniam skiedimui, iki skiedimo, kuris lygus MAD. Daugeliu atvejų papildomas tiriamo vaistinio preparato praskiedimas gali pašalinti trukdančių veiksnių poveikį. Didesnio jautrumo LAL reagento naudojimas leis padidinti praskiedimo laipsnį.

Trukdančių veiksnių poveikį galima įveikti tinkamai paruošus mėginį, pvz., filtruojant, neutralizuojant, dializuojant ar apdorojant temperatūrą. Pasirinktas trukdančių faktorių pašalinimo metodas neturėtų keisti bakterijų endotoksinų koncentracijos tiriamame vaiste, todėl žinomos koncentracijos ERS įpilamas į tiriamo vaistinio preparato tirpalą prieš tokį apdorojimą, kol atliekama trukdančių faktorių analizė. po to lauk. Jei pasirinktas apdorojimo būdas yra susijęs su patenkinamais trukdančių faktorių tyrimo rezultatais, tiriamame vaistiniame preparate gali būti tiriamas bakterijų endotoksinų kiekis.

Jei trukdančių veiksnių negalima pašalinti iš tiriamo vaistinio preparato, pastarojo negalima tirti dėl bakterijų endotoksinų kiekio naudojant LAL testą.

KOKYBINĖ ANALIZĖ (A metodas)

Šios analizės tikslas – parodyti, kad bakterinių endotoksinų kiekis tirtame vaistinio preparato mėginyje neviršija Farmakopėjos monografijoje nurodyto Maksimalaus bakterinių endotoksinų kiekio.

Procedūros aprašymas. Šiai analizei A–D sprendimai turi būti parengtas pagal 3 lentelėje pateiktus reikalavimus.

Sprendimas A– tirtas vaistinis preparatas praskiedime, kuriame nėra trukdančių faktorių, arba didesniu praskiedimu, jei jis neviršija MAD vertės.

Sprendimas B– tiriamas vaistinis preparatas pasirinktu skiedimu, pridėjus endotoksino etaloninį standartą. Galutinė endotoksino koncentracija analizuojamame tirpale turi būti 2λ (teigiama tiriamojo vaistinio preparato kontrolė).

Sprendimas C– ERS tirpalas vandenyje, skirtas LAL bandymui, kurio galutinė koncentracija 2λ (teigiama kontrolė).

Sprendimas D– Vanduo LAL testavimui (neigiama kontrolė).

3 lentelė- Eksperimento planavimas, „Kokybinė analizė“

Rezultatai ir interpretacija .

• dėl Sprendimas D
• dėl Sprendimas C(teigiama kontrolė) – visuose pakartojimuose gaunami teigiami rezultatai;
• dėl Sprendimas B(teigiama tirto mėginio kontrolė) – abiejuose kartojiniuose gaunami teigiami rezultatai.

Jei gaunami neigiami rezultatai Sprendimas A abiejuose pakartojimuose vaistinis preparatas atitinka tyrimo reikalavimus.

Jei abiejuose pakartojimuose gaunamas teigiamas bandomojo vaisto skiedimo, mažesnio nei MAD, rezultatas, bandymas turi būti kartojamas didesniam skiedimui arba skiedimui, lygiam MAD.

Jei tiriamo vaistinio preparato praskiedimo, lygaus MAD, abiejų pakartojimų rezultatas yra teigiamas, toks vaistinis preparatas neatitinka Farmakopėjos monografijos Bakterijų endotoksinų skyriaus reikalavimų.

Jei vieno iš pakartojimų gautas teigiamas rezultatas Sprendimas A, reikia atlikti pakartotinį tyrimą. Jei antrojo tyrimo metu gaunami neigiami abiejų pakartojimų rezultatai, toks vaistinis preparatas išlaikė testą.

KIEKYBINĖ ANALIZĖ (B metodas)

Šis metodas skirtas bakterijų endotoksinų kiekiui nustatyti naudojant sėkmingų bandomojo vaisto skiedimų seriją.

Procedūros aprašymas. Šiai analizei A–D sprendimai turi būti parengtas pagal 4 lentelėje pateiktus reikalavimus.

Sprendimai A– tiriamo vaistinio preparato skiedimai, pradedant nuo skiedimo, kuriame nėra trukdančių faktorių, iki didžiausio skiedimo, neviršijančio MAD vertės.

Sprendimas B– mažiausias A tirpalo serijinių skiedimų, į kuriuos buvo pridėtas ERS tirpalas, skiedimas. Galutinė endotoksino koncentracija analizuojamame tirpale turi būti 2λ (teigiama tiriamojo mėginio kontrolė).

Sprendimai C– ERS skiedimų vandenyje serija, skirta LAL bandymui (teigiama kontrolė).

Sprendimas D– Vanduo LAL testavimui (neigiama kontrolė).

Ši analizė atliekama taip, kaip aprašyta skyriuje „Procedūros aprašymas“.

4 lentelė — Eksperimento planavimas, „Kiekybinė analizė“

Rezultatai ir interpretacija. Bandymas turėtų būti laikomas patikimu, jei tenkinamos šios sąlygos:

• dėl Sprendimas D(neigiama kontrolė) – abiejuose pakartojimuose gaunami neigiami rezultatai;
• už Sprendimai C serija (teigiama kontrolė) – bakterijų endotoksinų koncentracijos geometrinis vidurkis turi būti ne mažesnis kaip 0,5λ ir ne didesnis kaip 2λ;
• dėl Sprendimas B(teigiama tirto mėginio kontrolė) – teigiami rezultatai gaunami dviem pakartojimais;
• už Sprendimai A serija – reakcijos galutinis taškas yra teigiamas rezultatas, gautas didžiausiam tiriamo vaistinio preparato praskiedimui.

Atitinkamas praskiedimo koeficientas, padaugintas iš LAL reagento jautrumo vertės (λ), yra lygus endotoksino koncentracijai Sprendimas A gautas šiam konkrečiam kopijai.

Endotoksino koncentracijos geometrinė vidutinė vertė apskaičiuojama taip, kaip aprašyta „ Nurodyto LAL reagento jautrumo patvirtinimas" skyrius.

Jei gaunami neigiami rezultatai visuose kartojiniuose Sprendimai A serijos, bakterijų endotoksinų koncentracija tiriamame vaiste yra mažesnė už LAL reagento jautrumo vertę, padaugintą iš mažiausio praskiedimo koeficiento. Jei visuose kartojiniuose gaunami teigiami rezultatai Sprendimai A serijos, bakterijų endotoksinų koncentracija tiriamame vaistiniame preparate yra didesnė už LAL reagento jautrumo vertę, padaugintą iš didžiausio praskiedimo koeficiento.

Vaistinis preparatas išlaikė testą, jei tyrimo metu gauta vidutinė bakterinių endotoksinų kiekio vertė yra mažesnė už Farmakopėjos monografijoje nurodytą didžiausią bakterijų endotoksinų kiekį.

FOTOMETRIJI METODAI (C, D, E ir F metodai)

TURBIDIMETRINIAI METODAI (C ir F)

Turbidimetriniai metodai yra fotometrinių metodų variantas, pagrįstas reakcijos mišinio drumstumo matavimu. Priklausomai nuo bandymo principo, šis metodas gali būti atliekamas kaip baigties turbidimetrinis bandymas arba kinetinis turbidimetrinis tyrimas.

Galutinis turbidimetrinis testas (F metodas) pagrįstas reakcijos mišinio drumstumo matavimu inkubacijos laikotarpio pabaigoje, kuris priklauso nuo endotoksino koncentracijos.

Kinetinis drumstumo tyrimas (C metodas) pagrįstas reakcijos mišinio drumstumo vystymosi greičio nustatymu, įvertintu pagal laiką, kurio reikia norint pasiekti tikslinę optinio tankio vertę.

Chromogeniniai METODAI (D ir E)

Chromogeniniai metodai naudojami chromoforo, išsiskiriančio iš chromogeninio substrato, kiekiui dėl reakcijos tarp endotoksinų ir LAL reagento nustatyti. Atsižvelgiant į principą, kuriuo grindžiamas bandymas, šis metodas gali būti atliekamas kaip galutinio taško chromogeninis tyrimas arba kaip kinetinis chromogeninis tyrimas.

Galutinis chromogeninis testas (E metodas) pagrįstas reakcijos mišinio spalvos intensyvumo matavimu, kuris priklauso nuo chromoforo kiekio, išsiskiriančio inkubacijos laikotarpio pabaigoje. Išsiskyrusio chromoforo kiekis priklauso nuo endotoksino koncentracijos.

Kinetinio chromogeninio tyrimo metu (D metodas) nustatomas reakcijos mišinio spalvos raidos greitis; jis vertinamas pagal laiką, kurio reikia norint pasiekti tikslinę reakcijos mišinio optinio tankio vertę.

Šis bandymas atliekamas inkubavimo temperatūroje, kurią rekomenduoja LAL reagento gamintojas (paprastai 37 ± 1 °C).

PARENGIMASIS BANDYMAS

Norint įrodyti turbidimetriniu arba chromogeniniu metodu gautų tyrimų rezultatų tikslumą ir patikimumą, reikia atlikti preliminarius bandymus, siekiant įsitikinti, kad standartinės kreivės kriterijai yra patikimi ir ar tiriamame tirpale nėra veiksnių, trukdančių reakcijos eigai.

Bet kokiems pakeitimams, kurie gali turėti įtakos šio eksperimento rezultatams, reikia papildomai patvirtinti šio testo patikimumą ir tikslumą.

Šią analizę reikia atlikti kiekvienai naujai LAL reagento partijai.

Norint gauti standartinę kreivę, pagal LAL reagento gamintojo rekomendacijas iš pradinio ERS tirpalo reikia paruošti ne mažiau kaip tris skirtingas endotoksino koncentracijas. Bandymas turi būti atliekamas naudojant bent pakartojimus LAL reagento gamintojo rekomenduojamomis sąlygomis (tūrio santykiai, inkubacijos laikas, temperatūra, pH vertė ir kt.).

Jei taikant kinetinį metodą reikalinga standartinė kreivė, kurios ERS intervalas viršija 2 lg endotoksino koncentracijos vertės kiekvienam endotoksino koncentracijos vertės lg matavimo intervalo pokyčiui, į šio metodo projektą turėtų būti įtrauktas atitinkamos koncentracijos ERS tirpalas. eksperimentas.

Absoliučios koreliacijos koeficientas |r| tiriamo endotoksino koncentracijos intervalo vertė turi būti lygi 0,980 arba didesnė.

Trukdantys veiksniai

Bandymas gali būti atliekamas su bet kokiu vaistiniu preparatu, kurio skiedimas neviršija MAD vertės.

Procedūros aprašymas. Tirpalai A – D turi būti ruošiami taip, kaip nurodyta 5 lentelėje. Tirpalus A, B, C ir D reikia tirti mažiausiai dviem pakartojimais, vadovaujantis LAL reagento gamintojo rekomendacijomis (tiriamo vaisto tūrio ir tūrio santykiais). produktas ir LAL reagentas, inkubacijos laikas, temperatūra, pH vertė ir kt.).

5 lentelė- Eksperimento planas, „Trikdantys veiksniai“

SprendimasA- tiriamo vaistinio preparato tirpalas neviršijančiame MAD reikšmės;

SprendimasIN- išbandytas vaistinis preparatas pasirinktu skiedimu, pridėjus ERS. Galutinė endotoksino koncentracija analizuojamame tirpale turi būti lygi arba artima vidutinei ERS koncentracijų vertei, naudotai nubraižant standartinę kreivę (teigiama tiriamojo mėginio kontrolė);

SprendimaiSU- ERS tirpalai, naudojami standartinei kreivei nubraižyti, esant toms pačioms koncentracijoms, kurios buvo naudojamos Standartinių kreivės kriterijų patikimumo patikrinimas"(teigiama kontrolė);

D tirpalas – vanduo LAL tyrimui (neigiama kontrolė).

– standartinei kreivei gauti rezultatai (Sprendimas C) atitinka patikimumo kriterijus, nustatytus skyrelyje „Standartinės kreivės kriterijų patikimumo patikra“;

– D tirpalo (neigiama kontrolė) gautas rezultatas neviršija naudoto LAL reagento naudojimo instrukcijoje nurodytos reikšmės arba yra mažesnis už taikytu metodu nustatytą endotoksino koncentraciją.

Eksperimentinė vidutinė pridėto endotoksino koncentracija apskaičiuojama atėmus vidutinę endotoksino koncentraciją SprendimasA(jei yra) nuo vidutinės endotoksino koncentracijos SprendimasIN(kurių sudėtyje yra pridėto endotoksino).

Laikoma, kad tiriamame tirpale nėra trukdančių faktorių, jei išmatuota į tiriamąjį tirpalą įdėto endotoksino koncentracija yra 50–200 % žinomos pridėto endotoksino koncentracijos bandymo sąlygomis.

Jei eksperimento metu nustatyta endotoksino koncentracija yra už nustatytų ribų, daroma išvada, kad tiriamame vaistiniame preparate yra reakciją trukdančių veiksnių. Tokiu atveju bandymas gali būti kartojamas didesniu praskiedimu iki praskiedimo, lygaus MAD. Be didesnio tiriamojo vaistinio preparato praskiedimo, trukdančių veiksnių poveikį galima įveikti tinkamai apdorojant, pavyzdžiui, filtruojant, neutralizuojant, dializuojant arba apdorojant temperatūrą. Pasirinktas trukdančių faktorių pašalinimo metodas neturi mažinti bakterinių endotoksinų koncentracijos tiriamame vaiste, todėl prieš tokį apdorojimą į tiriamąjį tirpalą pirmiausia reikia įpilti žinomos koncentracijos ERS tirpalo, o vėliau atlikti „Trikdančių veiksnių“ analizę. pasikartoti. Jei tyrimo rezultatai gauti po to, kai pasirinktas apdorojimo būdas yra patenkinamas, tiriamame vaistiniame preparate gali būti tiriamas bakterijų endotoksinų kiekis.

Bandymo procedūra

Procedūros aprašymas. Bandymas turi būti atliekamas pagal procedūros aprašymą, pateiktą skyriuje „Trikdantys veiksniai“.

Rezultatai . Endotoksino koncentracija turėtų būti nustatyta kiekvienam kartojimui SprendimasA naudojant standartinę kreivę, gautą naudojant ERS serijinius skiedimus ( SprendimasSU).

Bandymo rezultatai laikomi patikimais, jei įvykdomos šios sąlygos:

1. rezultatai gauti standartinei kreivei ( SprendimaiSU) atitikti skyrelyje „Standartinių kreivės kriterijų patikimumo patikrinimas“ nustatytus patikimumo kriterijus;
2. pridėto endotoksino eksperimentinė koncentracija Sprendimas B atėmus nustatytą endotoksino koncentracijos reikšmę SprendimasA yra nuo 50 % iki 200 % žinomos vertės;
3. gautas rezultatas Sprendimas D(neigiama kontrolė) neviršija naudoto LAL reagento naudojimo instrukcijoje nurodytos reikšmės arba yra mažesnė už endotoksino koncentraciją, nustatytą taikytu metodu.

Rezultatų interpretacija. Vaistas išlaiko testą, jei nustatytas eksperimentinis vidutinis bakterijų endotoksinų kiekis SprendimasA pakartojimų (pakoreguotas pagal tiriamo vaistinio preparato skiedimą ir koncentraciją) yra mažesnis nei Farmakopėjos monografijoje nurodyta bakterijų endotoksinų kiekio viršutinė riba.

Viena iš gyvosios gamtos karalysčių apima vienaląsčius gyvus organizmus, klasifikuojamus į Bakterijų skyrių. Dauguma jų rūšių gamina specialius cheminius junginius – egzotoksinus ir endotoksinus. Šiame straipsnyje bus nagrinėjama jų klasifikacija, savybės ir poveikis žmogaus organizmui.

Kas yra toksinai

Medžiagos (daugiausia baltyminės arba lipopolisacharidinės), išsiskiriančios į tarpląstelinį skystį po jo mirties, yra bakterijų endotoksinai. Jei gyvas prokariotinis organizmas gamina toksiškas medžiagas į šeimininko ląstelę, tai mikrobiologijoje tokie junginiai vadinami egzotoksinais. Jie turi destruktyvų poveikį žmogaus audiniams ir organams, būtent: jie inaktyvuoja fermentinį aparatą ląstelių lygiu ir sutrikdo medžiagų apykaitą. Endotoksinas yra nuodas, žalojantis gyvas ląsteles, o jo koncentracija gali būti labai maža. Mikrobiologijoje žinoma apie 60 junginių, kuriuos išskiria bakterijos ląstelės. Pažvelkime į juos išsamiau.

Lipopolisacharidinis bakterijų nuodų pobūdis

Mokslininkai išsiaiškino, kad endotoksinas yra išorinės membranos irimo produktas.Tai kompleksas, susidedantis iš sudėtingų angliavandenių ir lipidų, kurie sąveikauja su tam tikro tipo ląstelių receptoriais. Toks junginys susideda iš trijų dalių: lipido A, oligosacharido molekulės ir antigeno. Tai pirmasis į kraują patekęs komponentas, sukeliantis didžiausią žalingą poveikį, kartu su visais sunkaus apsinuodijimo požymiais: dispepsiniais simptomais, hipertermija, centrinės nervų sistemos pažeidimais. Kraujo apsinuodijimas endotoksinais įvyksta taip greitai, kad organizme išsivysto septinis šokas.

Kitas struktūrinis elementas, įtrauktas į endotoksiną, yra oligosacharidas, turintis heptozės - C 7 H 14 O 7. Į kraują patekęs centrinis disacharidas taip pat gali sukelti organizmo intoksikaciją, tačiau lengvesne forma nei lipidui A patekus į kraują.

Endotoksinų įtakos žmogaus organizmui pasekmės

Dažniausios bakterinių nuodų poveikio ląstelėms pasekmės yra trombohemoraginis sindromas ir septinis šokas. Pirmojo tipo patologija atsiranda dėl medžiagų – toksinų, kurie mažina jo krešėjimą, patekimo į kraują. Tai sukelia daugybę organų, susidedančių iš jungiamojo audinio - parenchimos, pažeidimų, tokių kaip plaučiai, kepenys, inkstai. Jų parenchimoje atsiranda daug kraujavimų, o sunkiais atvejais - kraujavimas. Kitas patologijos tipas, atsirandantis dėl bakterinių nuodų poveikio, yra septinis šokas. Tai sukelia kraujo ir limfos apytakos sutrikimus, kurių pasekmės yra deguonies ir maistinių medžiagų transportavimo į gyvybiškai svarbius organus ir audinius: smegenis, plaučius, inkstus, kepenis, sutrikimai.

Žmogui smarkiai padaugėja gyvybei pavojingų simptomų, tokių kaip greitas kraujospūdžio kritimas, hipertermija ir greitai besivystantis ūminis širdies ir kraujagyslių sistemos nepakankamumas. Skubi medicininė intervencija (hormonų ir antibiotikų terapija) sustabdo endotoksino poveikį ir greitai pašalina jį iš organizmo.

Išskirtinės egzotoksinų savybės

Prieš išsiaiškindami šio tipo bakterijų nuodų specifiką, prisiminkime, kad endotoksinas yra vienas iš negyvos gramneigiamos bakterijos ląstelės sienelės lizato komponentų. Egzotoksinus sintetina gyvi gramteigiami ir gramneigiami organizmai. Cheminės struktūros požiūriu tai yra tik mažos molekulinės masės baltymai. Galima teigti, kad pagrindines klinikines apraiškas, atsirandančias infekcinių ligų metu, sukelia būtent žalingas egzotoksinų poveikis, kuris susidaro dėl pačios bakterijos metabolizmo.

Mikrobiologiniai tyrimai parodė didesnį bakterijų nuodų tipą nei endotoksinai. Stabligės, kokliušo, difterijos sukėlėjai gamina toksiškas baltyminio pobūdžio medžiagas. Jie yra termolabūs ir sunaikinami, kai kaitinami 70–95 laipsnių Celsijaus temperatūroje 12–25 minutes.

Egzotoksinų rūšys

Šio tipo bakterinių nuodų klasifikacija grindžiama jų poveikio ląstelių struktūroms principu. Pavyzdžiui, išskiriami membranų toksinai, kurie ardo šeimininko ląstelės membraną arba sutrikdo jonų, praeinančių per membranos dvisluoksnį, difuziją. Taip pat yra citotoksinų. Tai nuodai, veikiantys ląstelės hialoplazmą ir sutrikdantys asimiliacijos bei disimiliacijos reakcijas, vykstančias ląstelių metabolizme. Kiti nuodingi junginiai „veikia“ kaip fermentai, pavyzdžiui, hialuronidazė (neurominidazė). Jie slopina žmogaus imuninės sistemos funkcionavimą, tai yra, inaktyvuoja B limfocitų, monocitų ir makrofagų gamybą limfmazgiuose. Taigi proteazės naikina apsauginius antikūnus, o lecitinazė skaido lecitiną, kuris yra nervinių skaidulų dalis. Dėl to sutrinka bioimpulsų laidumas ir dėl to sumažėja organų ir audinių inervacija.

Citotoksinai gali veikti kaip plovikliai, taip suardydami ląstelės šeimininkės membranos lipidinio sluoksnio vientisumą. Be to, jie gali sunaikinti tiek atskiras kūno ląsteles, tiek su jais susijusius audinius, todėl susidaro biogeniniai aminai, kurie yra medžiagų apykaitos reakcijų produktai ir pasižymi toksinėmis savybėmis.

Bakterinių nuodų veikimo mechanizmas

Mikrobiologiniai tyrimai parodė, kad endotoksinas yra sudėtinga struktūra, turinti 2 molekulinius centrus. Pirmasis prijungia toksinę medžiagą prie konkretaus ląstelės receptoriaus, o antrasis, suskaidydamas jos membraną, patenka tiesiai į ląstelės hialoplazmą. Joje toksinas blokuoja medžiagų apykaitos reakcijas: ribosomose vykstančių baltymų biosintezę, mitochondrijų vykdomą ATP molekulių sintezę ir nukleorūgščių replikaciją. Didelis bakterijų peptidų virulentiškumas jų molekulių cheminės struktūros požiūriu paaiškinamas tuo, kad kai kurie toksinų lokusai yra užmaskuoti kaip ląstelėje esančių medžiagų, tokių kaip neurotransmiteriai, hormonai ir fermentai, erdvinė struktūra. Tai leidžia toksinui „apeiti ląstelių gynybos sistemą“ ir greitai prasiskverbti į jo citoplazmą. Taigi ląstelė tampa neapsaugota nuo bakterinės infekcijos, nes praranda gebėjimą formuoti savo apsaugines medžiagas: interferoną, gama globulinus, antikūnus. Pažymėtina, kad endotoksinų ir egzotoksinų savybės yra panašios tuo, kad abiejų tipų bakteriniai nuodai veikia specifines organizmo ląsteles, tai yra, yra labai specifinės.

Endotoksinai Endotoksinai

lipopolisacharidų kompleksai su baltymais ląstelių sienelės gramneigiamas bakterijos, turintys savybių nuodų Jie turi antigeninių savybių, identiškų visos ląstelės somatiniams antigenams (O-antigenams). Skirtingai nei egzotoksinai termostabilūs. Izoliuotas nuo visų patogeninių gramneigiamų bakterijų (Salmonella, Vibrio cholerae, Shigella ir kt.); šiuo pagrindu meduje mikrobiol. vadinami enterotoksinais. Jie yra pirogeniški (sukelia kūno temperatūros padidėjimą) ir toksiški; pirmąją savybę lemia E. lipopolisacharidų frakcija, antrąją – baltymų frakcija. E. pirogeniškumas ir toksiškumas yra nespecifiniai ir manoma, kad jie atlieka tik pagalbinį vaidmenį ligos sukėlėjo patogenezėje.

(Šaltinis: „Mikrobiologija: terminų žodynas“, Firsov N.N., M: Drofa, 2006)

Endotoksinai

toksinės medžiagos, kurios patenka į bakterijų struktūrą (dažniausiai į ląstelės sienelę) ir išsiskiria iš jų po bakterijų lizės. Dažniau šis pavadinimas vartojamas kalbant apie grambakterijų ląstelių sienelės lipopolisacharidus, kurių m.m. 100 - 900 tūkst., kurie sudaro kompleksinį makromolekulinį kompleksą su baltymais ir lipidais. Nepriklausomai nuo rūšies, E yra panašios struktūros ir cheminės sudėties, pasižymi dideliu ir įvairiu aktyvumu. Eksperimentinėmis ir pleištinėmis sąlygomis E sukelia karščiavimą, leukocitozę su greitu perėjimu į leukopeniją, hipoglikemiją, žemą kraujospūdį ir šoką, Sanarelli-Schwartzmann. reiškinys, naviko nekrozė, padidina nespecifinių imuninių faktorių aktyvumą, turi adjuvantinį ir didelį antigeninį aktyvumą. Toksinis E poveikis pasireiškia iškart po vartojimo, yra mažiau ryškus nei egzotoksinų, turi mažai specifiškumo ir yra neatsiejamai susijęs su antigeniškumu: praradus toksiškumą, prarandamas antigeniškumas. E. veikimo mechanizmas yra susijęs su ląstelių membranos fosforilazės aktyvavimu ir vėlesniu arachidono rūgšties išsiskyrimu, taip pat su padidėjusia prostaglandinų, leukotrienų ir tromboksanų sinteze. Šie uždegimo mediatoriai skatina leukocitų ir trombocitų agregaciją ir veikia kraujagyslių tonusą bei pralaidumą. Cm. Bakterijų toksinai.

(Šaltinis: Mikrobiologijos terminų žodynas)

Pažiūrėkite, kas yra „endotoksinai“ kituose žodynuose:

Bakterijoms toksiškos medžiagos, kurios yra tam tikrų bakterijų struktūriniai komponentai ir išsiskiria tik tada, kai bakterijos ląstelė lizuojasi (irsta). Tai išskiria endotoksinus nuo egzotoksinų, tirpių junginių,... ... Vikipedijos

ENDOTOKSINAI- (nuo endo... ir toksinų), bakterijų toksinai, toksinės medžiagos, susidarančios mikroorganizmų viduje (ypač gramneigiamos bakterijos). Tvirtai susijungia su ląstelių struktūra ir išsiskiria, kai ląstelės suyra arba sunaikinamos... ... Ekologijos žodynas

ENDOTOKSINAI- ENDOTOKSINAI, žr. Toksinai. 3HflO0TA/lbMHT(endoftalmitas), anot Fuchso, rainelės ir ciliarinio kūno uždegimas, iridociklitas, rečiau iridochoroiditas, po perforuotų akies žaizdų (pirminis E.) arba infekcijai prasiskverbus per... ... Didžioji medicinos enciklopedija

endotoksinų- Toksiškos medžiagos, glaudžiai susijungusios su bakterijų ląstelių struktūromis ir išsiskiriančios, kai ląstelės suyra arba sunaikinamos dėl fizinių ar cheminių veiksnių poveikio. Taip pat žiūrėkite Toksinai. [Anglų-rusų kalbų žodynėlis... ... Techninis vertėjo vadovas

- (žr. endo...) mikrobų irimo metu išsiskiriantys nuodai (toksinai), jų mirtis plg. egzotoksinai). Naujas svetimžodžių žodynas. pateikė EdwART, 2009. endotoksinai [žr endo... + toksinai] – bakterijų irimo metu išsiskiriantys bakteriniai nuodai Didelės... ... Rusų kalbos svetimžodžių žodynas

Panašūs straipsniai